[发明专利]二乙基对硝基苯磷酸酯酶活力测定方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学、兽医学、生物学的研究，以及人、动物或微生物等领域内二乙基 对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的检测，尤其涉及利用Trinder反应测定二乙基对硝基苯磷酸 酯酶活力的方法，以及由此制得的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，属于体外诊断试 剂技术领域。

背景技术

血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶，主要在肝脏产生，其作用是水解组织中磷酸 酯。血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶与人体中的高、低密度脂蛋白代谢有关。二乙基对硝 基苯磷酸酯酶可以保护低密度脂蛋白，避免氧化修饰，所以，可以认为，二乙基对硝基苯磷 酸酯酶是一种具有抗动脉粥样硬化以及抗炎作用的酶。

目前，市场上二乙基对硝基苯磷酸酯酶测定方法相对较少。申请号为CN 200610161226.5的专利，提供了一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶测定方法和诊断试剂盒，该 试剂盒利用二乙基对硝基苯磷酸酯酶和底物苯乙酸酯反应能生成乙酸，在醛脱氢酶的作用 下，使还原型辅酶氧化生成氧化型辅酶，在340nm处检测吸光度下降的速率，计算二乙基对 硝基苯磷酸酯酶活力。此方法灵敏度高，但试剂的稳定性不太好，醛脱氢酶价格贵，试剂的 pH不利于二乙基对硝基苯磷酸酯酶的反应。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，旨在提供一种测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活 力的方法，以及应用该方法配制的成本低、性质稳定的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂 盒。

本发明是将测定的样品与含有苯乙酸酯、过氧化物酶、显色剂和过氧化氢的试剂 混匀，使之发生以下反应：

将反应物置于紫外/可见光分析仪或半/全自动生化分析仪下，设定主波长为500nm，检 测反应物的吸光度上升速度，计算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活力大小；

试剂盒的试剂由以下成分组成：

缓冲液20～200mmol/L

稳定剂0.1～3g/L

过氧化氢（H₂0₂）0.01～0.50mmol/L

过氧化物酶0.5～5KU/L

苯乙酸酯1～100mmol/L

4-氨基安替比林0.05～0.50mmol/L；

所述的缓冲液可以是3-吗啉丙磺酸(Mops)、哌嗪-1，4-二乙磺酸、3-(N-吗啉)-2羟基丙 磺酸（Mpso）中的一种。

所述稳定剂为小牛血清白蛋白（BSA1～5g/L）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂0.1 ～3mmol/L）、乙二醇(5～30%v/v)中的一种或多种。

所述试剂能配成双试剂和三试剂，其中双试剂试剂盒成分组成如表1所示；

双试剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂Ⅰ中部分成分可与试剂Ⅱ的成分互 换，如此可以形成多种配方，不再一一列举，配成液体试剂，直接使用。

三试剂试剂盒成分组成如表2所示。

使用前将试剂Ⅲ加入试剂Ⅱ中。

与双试剂类似，三试剂的配方也不仅仅限于上述配方，试剂Ⅰ与试剂Ⅱ中部分可以 互换，如此可以形成多种配方，配成液体试剂，直接使用。

所述试剂盒为液体试剂。

研究表明，无论是双还是三试剂，试剂最终反应时各成分的量应达到如下浓度较 为理想，是本发明的最佳方案：

缓冲液120mmol/L

稳定剂2g/L

过氧化氢（H₂0₂）0.05mmol/L

过氧化物酶2KU/L

苯乙酸酯20mmol/L

4-氨基安替比林0.25mmol/L。

本发明技术最突出的特点主要表现在：

（1）本发明利用Trinder反应来测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活力，该方法灵敏度 高，试剂稳定性好，测试结果准确；

（2）科学合理地搭配各原料组份，各组分和反应生成物之间不会产生干扰，检测结果精 确度高；

（3）该方法简便、易操作，试剂成本很低，检测快速准确，反应物和生成物都不会对环境 有害；

（4）该方法在普通、紫外分光光度或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，便 于行业内推广应用；