[发明专利]西瓜ClCP2基因的启动子及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地指一种西瓜ClCP2(Cla016594)基因的启动子及其制备方法和应用。

背景技术

植物基因的启动子是位于基因5’端上游区、含有顺式作用元件的一段DNA序列，决定着下游基因转录的特异性、方向和效率，是基因转录调控机制和表达模式中最关键的因子。此外，外源基因在植物细胞中表达是植物基因工程研究的关键，而外源基因的表达首先取决于其转录的启动，在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。因此，发掘和研究新型启动子对于基因表达调控机制研究和转基因研究具有非常重要的科学意义。

通过对多种植物基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式，一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20～-30bp处的TATAbox为启动子核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA(脱氧核糖核酸)双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATAbox上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游-75bp处的CAATbox和-80--110bp附近的GCbox等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件，如ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件、参与植物胁迫应答响应元件W-box(TGACC)等(杜皓等，受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析。作物学报，2015，41(4)：593-600)。CAATbox是比较保守的序列，与RNA(核糖核酸)聚合酶的识别和结合有关，对基因转录有较强的激活作用。然而有些基因无此框，如禾谷类作物的贮藏蛋白基因中无CAAT框而被CATC框代替。GCbox的保守序列是5′GGGCGG3′，可有多个拷贝，并能以任何方向存在而不影响其功能(路静，赵华燕，何奕昆，宋艳茹，高等植物启动子及其应用研究进展。自然科学进展，2004，14(8)：856-862；夏江东，陈在全，吴渝生，季鹏章，高等植物启动子功能和结构研究进展。云南农业大学学报，2006，21(1)：7-14)。只要具有了这些保守的结构框，那么就可以具有相应的启动下游基因表达的功能。

近年来，对启动子的功能研究，大量文献报道采用的方法通常是先用生物信息学初步预测和分析启动子序列后,再将启动子片段与报告基因融合构建表达载体，转化模式植物拟南芥、烟草、水稻等,再通过检测报告基因在转基因个体中的表达情况来分析启动子的功能并加以利用。大量的文献报道显示其他植物的启动子转化到上述植物中均可正常的行使其生物功能，如：从马铃薯中分离的一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511(tran-scriptderivedfragment)基因Stgan的启动子，构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草,GUS组织化学染色显示该启动子驱动基因在烟草茎结节处特异表达,可能参与块茎形成过程(TrindadeLM,etal.Isolationandfunctionalcharacterizationofastolonspecificpromoterfrompotato(SolanumtuberosumL.).Gene,2003,303:77-84.)。在芝麻中克隆的微粒体油酸脱氢酶基因(FAD2)的启动子,此启动子中的E-box和G-box元件与三酰甘油的生物合成有关。在转基因拟南芥和其他转基因植物中也显示出了种子特异性的表达(MiJungKim,HeejaKim,MiChungSuh.Seed-specificexpressionofsesamemicrosomaloleicaciddesaturaseiscontrolledbycombinatorialpropertiesbetweennegativecis-regulatoryelementsintheSeFAD2promoterandenhancersinthe5′-UTRintron.MolecularGeneticsandGenomics.2006,276(4):351-368)。从玉米中克隆的ZmGLU1基因启动子,连接GUS报告基因后转化至烟草中，检测分析结果玉米的ZmGLU1启动子驱动了GUS基因在烟草根部高效表达(RiliangGu,LiZhao,GuoyingWang.Isolationofamaizebeta-glucosidasegenepromoterandcharacterizationofitsactivityintransgenictobacco.PlantCellReports.2006,25(11):1157-1165)。以上这些报道都是利用转基因技术在不同的植物间进行启动子功能分析的例子，这些实例表明利用模式植物拟南芥、烟草等作为载体，通过转基因植株的表达分析证实来自于其他植物的启动子的功能是被广泛认可和接受的。