[发明专利]一种嗜热酯酶AFEST突变体及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一种嗜热酯酶AFEST突变体，该嗜热酯酶AFEST突变体的氨基酸序列与野生型嗜热酯酶AFEST的氨基酸序列SEQ ID NO.2有1‑5个氨基酸残基的不同；所述不同包括氨基酸的替换、缺失或者插入。进一步地，不同体现在L47R、S 111T、A166V或者D175V。本发明还保护一种编码该嗜热酯酶AFEST突变体的基因，包含该基因的重组载体，以及包含该基因的工程菌。本发明还公开了该嗜热酯酶AFEST突变体的筛选方法，和在水解短链羧酸酯底物中的应用。本发明的嗜热酯酶AFEST突变体对对硝基苯酚丁酸酯的水解活性提高了4倍以上，且保持了与野生型嗜热酯酶AFEST相当的热稳定性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种嗜热酯酶AFEST突变体及其筛选方法和应用。

背景技术

酯酶(Esterase)是一种用途十分广泛的生物催化剂，不仅可催化各种酯类在水相中的水解，也能在非水相中催化酯的合成、转酯等反应，常被用于洗涤剂、造纸工业、食品、制药工业及生物能源等方面。然而，由于天然酶都是在体内比较温和的环境中发挥作用的，而工业应用过程要求酶在比较严苛的环境(如高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等)中发挥作用，因此天然酶在应用中往往遇到稳定性差、催化效率低等问题。为此必须选择稳定性良好、催化效率高的酶来满足工业生产的要求。

来自嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus(闪烁球菌)的嗜热酯酶(AFEST)是目前稳定性最好的酯酶之一，其最适催化温度高达80摄氏度(Manco G,GiosuèE,D'Auria S,Herman P,Carrea G,Rossi M.Cloning,overexpression,and properties of a newthermophilic and thermostable esterase with sequence similarity to hormone-sensitive lipase subfamily from the archaeon Archaeoglobus fulgidus.ArchBiochem Biophys.2000,373(1):182-92.)。除了良好的热稳定性，AFEST还具有非常广泛的底物谱，能够催化一系列不同碳链长度、不同化学结构的酯底物。作为极具工业应用潜力的酯酶，虽然AFEST对上述底物已有较高的催化活性，但如果能够进一步提高其活力，则可以降低酶用量，缩短反应时间，从而降低工业生产成本。

天然能够产生AFEST的原始菌种(如Archaeoglobus fulgidus)培养条件苛刻，利用发酵原始菌株获得目标酶较为困难。另外，野生型菌株产酶水平非常低。此外，野生型菌株所产的酶系复杂，无法直接应用，而且目的酶的纯化困难，难以直接应用。