[发明专利]一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用，属于生物技术技 术领域。

背景技术

褐藻酸(alginate,alginicacid)又名褐藻胶、海藻胶，是一种主要来源于海产褐藻的酸性多 糖。褐藻酸是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate，M)与其差向异构体α-L-古罗糖醛酸 (α-L-guluronate,G)两种单体通过1,4糖苷键连接而成的非支链多糖。目前商品化的褐藻 酸多以褐藻酸盐的形式存在。褐藻酸盐具有良好的亲水性、成凝胶、粘稠性以及生物相容性， 广泛应用于食品、医药和化工等多个领域。而褐藻酸降解产物-褐藻低聚糖/褐藻寡糖具有抗 肿瘤、促进生长、增强免疫活性、抗氧化、抗炎等多种生物学活性和药用价值，近年来受到 广泛的关注，成为新的研究热点。

褐藻酸裂解酶能够催化褐藻酸的降解，通过β-消除机制作用于含有古洛糖和甘露糖的 C-O糖苷键，在产物的非还原末端C4,5间生成不饱和糖醛酸 4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronicacid。该酶根据作用底物的不同可分为β-D-1,4- 甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3，PM型)和α-L-1,4-古洛糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11，PG 型)。聚甘露糖醛酸和聚古罗糖酸酸片段是褐藻酸分子所特有的，赋予了褐藻低聚糖和褐藻 寡糖多样的生物学活性，在医药、保健品领域具有广阔的开发应用前景，其需求量也越来越 大。相对于传统的酸解生产方式，用褐藻酸裂解酶酶法制备褐藻低聚糖/寡糖具有反应条件 温和、可操控性强、产率高等优点，因而成为褐藻资源生物高值化应用的强有利的工具。

褐藻酸裂解酶在自然界中广泛分布，主要来源于微生物，海洋藻类、海洋软体动物和棘 皮动物等。细菌来源的褐藻酸裂解酶种类多，来源广，便于生产，便于异源表达等特点具有 很好的应用潜力。微生物产生的褐藻酸裂解酶大多是中温酶，而低温和适冷的耐盐褐藻酸裂 解酶则鲜有报导。适冷耐盐褐藻酸裂解酶在低温高盐条件下具有很高的活性，在食品和医药 领域具有很大的应用潜力。新型适冷耐盐褐藻酸裂解酶的发现对于该酶的研究及应用都具有 重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用。

一株冷单胞菌(Psychromonassp.)C-3，2015年12月14日保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号CCTCCM2015748。

一种海洋褐藻酸裂解酶基因c3，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

上述基因编码的海洋褐藻酸裂解酶C3，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋褐藻酸裂解酶C3。

上述海洋褐藻酸裂解酶C3和/或上述海洋褐藻酸裂解酶基因c3在褐藻酸裂解中的应用。

褐藻酸裂解酶基因c3是从分离自北极黄河站海带样品的Psychromonassp.C3的基因组 DNA中克隆得到的。对具备褐藻酸降解能力的该菌株全基因测序，得到可能编码褐藻酸裂 解酶的基因c3，在信号肽预测网站预测其信号肽长度，并根据其序列设计特异性引物，利 用PCR技术从Psychromonassp.C3的基因组DNA中克隆了编码褐藻酸裂解酶的基因c3，构 建了含褐藻酸裂解酶基因c3的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞对该基因 的核酸序列进行了测定。测序结果表明褐藻酸裂解酶基因c3为一个含有861个核苷酸的开 放阅读框架，该开放阅读框架共编码286个氨基酸。运用在线信号肽预测网站SignalP预测 褐藻酸裂解酶C3的信号肽由20个氨基酸组成，因此褐藻酸裂解酶C3是一个含有20个氨 基酸的信号肽，共编码286个氨基酸的多肽。序列分析表明，褐藻酸裂解酶C3属于多糖裂 解酶第七家族。对切去信号肽的纯化的褐藻酸裂解酶C3进行性质测定。结果表明该酶对甘 露糖醛酸段表现出特异性降解。最适pH为8.0，且在pH6.0～10.0范围内稳定存在。最适 酶活温度为20℃，且在0℃仍保持超过40％的活力，表现出良好适冷性。C3对高浓度的NaCl 也表现出很好的耐受性。

有益效果：