[发明专利]一种生乳细菌总数荧光定量PCR检测方法在审
申请号: | 201510994556.1 | 申请日: | 2015-12-28 |
公开(公告)号: | CN105400899A | 公开(公告)日: | 2016-03-16 |
发明(设计)人: | 刘熙;盖冬雪;宋德刚;朱媛媛;刘少敏;刘艳艳;柳增善;孟宪梅 | 申请(专利权)人: | 广泽乳业有限公司 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/06 |
代理公司: | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 | 代理人: | 魏征骥 |
地址: | 130000 吉林省*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 细菌 总数 荧光 定量 pcr 检测 方法 | ||
1.一种生乳细菌总数荧光定量PCR检测方法,其特征在于包括下列步骤:
(一)分离鉴定生乳中细菌种类,并确定污染菌谱包括以下13株菌:格式乳球菌、中间葡萄球菌、血链球菌、克氏库克菌、阴沟肠杆菌、溶血性葡萄球菌、大肠埃希菌、蜂房哈夫尼亚菌、阪崎肠杆菌、绿浅气球菌、雷根斯堡约克氏菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯菌;
(二)分析污染菌谱中细菌序列,并设计16SrRNA通用引物:
引物1:5’-GCCACTCCTCAAGGGAACAA-3’
引物2:5’-TGACGCTCAGGTGCGAAAG-3’
(三)生乳样品前处理方法:取1mL行乳,12000g/min离心5min,弃掉上层脂肪与上清,无菌生理盐水洗两次,12000g/mL离心2min,无菌水重悬下层沉淀,100℃沸水浴30min提取细菌DNA,同时采用国标法计数加标样品细菌总数;
(四)以步骤(三)得到的DNA为模板进行荧光定量PCR反应:
20μL反应体系包括:PowerSYBRGreenPCRMasterMix10μL,上、下游引物各0.5μL,去离子水8μL,模板DNA1μL;
反应条件:95℃预变性10min,95℃变性30s,59℃,退火50s,72℃延伸30s,40个循环;
(五)检测结果判定标准
建立细菌常见污染菌谱中13种菌的细菌浓度(logCFU/mL)与CT值的标准曲线,分析不同细菌标准曲线,确定细菌浓度为2×106CFU/mL时对应的CT值,污染菌谱中蜂房哈弗尼亚菌CT值最低为:29.4,溶血性葡萄球菌CT值最高为:32.7;当检测样品的CT值﹥32.7时,样品为合格产品,可作为生乳;当CT值<29.4时,细菌总数超过2×106CFU/mL,样品为不合格产品;介于范围内的细菌总数2×106CFU/mL不应作为低温乳品的原料。
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