[发明专利]单细胞定位微孔膜及应用和单细胞自动化获取装置

说明书

技术领域

本发明属于稀有细胞检测领域，具体涉及一种从细胞悬液中获取单个细胞的微孔膜，及采用该微孔膜获取单个细胞的方法，还涉及一种单细胞自动化获取装置。

背景技术

单细胞分析已成为生物医学研究的热点领域，它能够揭示异质性较大细胞群体的分子特征，特别是一些数量极其稀少，却具有重要生物学功能或临床检测意义的细胞，如人外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的细胞，孕妇外周血中来自胎儿的有核红细胞，以及少量实体肿瘤样本中的肿瘤干细胞等，对其的捕获和检测分析意义就更为重大了。但是如何可靠获取单个细胞进行分析，尤其针对数目极少的稀有细胞，无疑是目前技术上的瓶颈。

这些稀有细胞在进一步分析之前往往需要加以富集，但即使在富集之后，这些稀有细胞的数目仍然极少且存在一定量其他的干扰细胞，需要一种可靠且自动化程度较高方法能够将这些珍贵的细胞一一取出并进行分析。

对单个细胞的操纵是属于对单细胞分析前的样本准备过程，要求将目标细胞从背景样本中分离出来然后运送至指定位置或处于指定环境中以便于下一步的单细胞分析。一个典型的应用场景是经过富集的循环肿瘤细胞样本中含有80个循环肿瘤细胞，500个白细胞，其中循环肿瘤细胞与白细胞可以通过针对细胞膜表面蛋白的免疫荧光染色来区分，为了从单细胞尺度上研究循环肿瘤细胞的分子特征，需要将80个循环肿瘤细胞一一取出并分别进行细胞裂解、基因组扩增以及靶基因的测序。

目前已有多种单细胞操纵的方法，常见的是通过显微操作仪、激光显微切割或光镊来获取靶细胞，能够对少量细胞样本进行处理，但自动化程度低、操作时间长，需要训练有素的操作人员且操作过程中细胞存在一定的损失率。流式细胞仪是另一种常见的细胞分选设备，能够将细胞逐个分到比如96孔板中的各个孔内，但这一技术的不足之处是其无法处理较少数目的细胞，难以对只含有几百甚至几十个细胞的样本进行可靠的分选。

微流控芯片是一种操控微量液体流动的芯片技术，非常适用于微量液体生物样本、少量细胞的操作与分析，且易于自动化并能够实现多项功能或模块的整合。比如Fluidigm公司的C1^TM单细胞自动前处理系统(Single-CellAutoPrepSystem)，通过微流控芯片上设计精巧的几何结构将单个细胞滞留在指定位置从而实现单细胞的捕获。每块芯片有96个捕获单元，当单个细胞被捕获后可以随即进行芯片上的细胞裂解，核酸扩增等步骤，完成整个单细胞操纵与处理过程，所获得的来自单细胞的核酸可转移至该公司的另一款设备进行分析以实现单细胞的基因分析。但是，这一系统仍然不太适合极少数目细胞的操纵，原因在于其操纵准确率低，从而靶细胞损失率较高，且无法处理混有除靶细胞以外其他细胞的样本，同时用于分选单个细胞的微流控芯片价格昂贵。另一种对单个细胞进行操纵的方式是在芯片外施加不均一的电场，从而将不同细胞移动至特定位置，比如SiliconBiosystems公司的DEPArray^TM系统可以操纵可移动的介电泳阱从细胞群体取出特定的单个细胞，虽然操纵准确，细胞损失率低，但其操作时间较长，通量很低，且该系统价格极其昂贵，难以装备一般实验室，更加无法应用于临床，普及性差。

综述所述，现有技术中用于单细胞操纵装置的优缺点汇总于表1。

表1