[发明专利]一种产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株。

技术背景

葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡 萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。葡萄糖苷酶来源广泛，几乎所有 以碳水化合物为能源的具有细胞结构的生物体内都有所存在。根据具有糖类活性的酶数据库 (Carbohydrate-ActiveenZYmesDatabase，CAZy)依据蛋白质晶体结构的同源性与功能的相 似性所进行的归类[2]，可将现已发现的糖苷水解酶分为133个糖苷水解酶家族 (GH1～GH133)，其中，葡萄糖苷酶主要分布在GH1、GH3、GH4、GH5、GH9、GH13、GH17、 GH30、GH31、GH63、GH97、GH116与GH122等糖苷水解酶家族中。

由于葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，因此，其所对应的葡萄糖苷酶分别被 称为α-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶。根据CAZy的具体分类，α-葡萄糖苷酶主要分布于GH4、 GH13、GH31、GH63、GH97以及GH122五个家族中；而β-葡萄糖苷酶主要分布于GH1、 GH3、GH5、GH9、GH17、GH30、GH116等七个家族中。

生产α-葡萄糖苷酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使 用的α-葡萄糖苷酶主要来自黑曲霉(Aspergillusniger)。由于能分泌α-葡萄糖苷酶的野生菌株 的生产能力普遍较低，因此如何进一步筛选出高产α-葡萄糖苷酶的生产菌株成为当前国内外 研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来外源的α- 葡萄糖苷酶基因在黑曲霉宿主菌中过表达，构建得到表达α-葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌，然 后通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得α-葡萄糖苷酶产量明显提高的 突变菌株，为该酶的广泛应用奠定了基础。

本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌，其携带有表达α-葡萄糖苷酶基因的重组质粒。

所述的α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；其编码基因的序列为SEQID NO:2。

本发明一方面提供了一株突变菌黑曲霉Su-A2(AspergillusnigerSu-A2)，已于2015年 11月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO： M2015681。

本发明所述黑曲霉Su-A2在生产α-葡萄糖苷酶中的应用。

本发明构建的黑曲霉工程菌Su-A1，在30L发酵罐发酵条件下其α-葡萄糖苷酶活力达到 14.68u/ml，蛋白表达量为3.5g/L。为了进一步提高其产酶能力，本发明通过基因敲除手段敲 除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得的突变菌株黑曲霉Su-A2，其α-葡萄糖苷酶活力达到 20.45u/ml，蛋白表达量为4.13g/L，比突变前分别提高了39.3％和18％，可以进行广泛应用。

附图说明

图1为质粒pGAU图谱；

图2为质粒pMD18T-pyrG图谱。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS INMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本 领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案 的基础上，采用本领域常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1α-葡萄糖苷酶基因的获得

根据公共基因数据库中的基因序列，设计引物从黑曲霉基因组中PCR扩增获得α-葡萄 糖苷酶基因AglU1(核苷酸序列为SEQIDNO：1)，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：2。

PCR引物和反应条件如下：