[发明专利]一种来源于恶臭假单胞菌的抗HPPD抑制剂基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域和植物遗传工程学领域，具体涉及一种来源于恶 臭假单胞菌的抗HPPD抑制剂基因及其在转基因植株中的应用。

背景技术

对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4一HPPD，EC1．13．11．27)是大部分生物体内催化酪氨 酸代谢的重要的酶lknderDA．AminoAcidMetabolism(2nded)[M]．Lon—don：John Wiley＆Sons，1985：208—221．它可催化酪氨酸降解产物对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸，尿 黑酸是植物体内一种重要物质，它可以进一步脱酸、聚戊二烯基化和烷基化，从而生成光 合作用中电子传递所需要的质体醌和生育酚（CrouchN.P.等人1997，Tetrahedron,53,20, 6993-7010,Fritze等人，2004，PlantPhysiology134:1388-1400）自从HPPD酶在20世纪30 年代被发现以来，已不断从鼠、鸡、猪、狗及人类的肝脏中以及假单细胞菌、玉米、胡萝卜、小 麦等体内提取出来BartaI.C.&P.B¨oger，PurificationandCharacterizationof 4-HydroxyphenylpyruvateDioxygenasefromMaixe，Pestic.Sci.，1996，48：109- 116.［5］。

已经证明HPPD抑制剂作用于靶酶HPPD，可有效抑制对羟苯基丙酮酸转化为尿黑 酸，从而导致质体醌和生育酚的合成受阻。质体醌和生育酚是光合作用中电子传递所需要 的重要物质，因而HPPD抑制剂同时起着光合作用电子传递抑制剂的角色。此外，质体醌还是 八氢番茄红素去饱和酶的关键辅助因素，质体醌的减少使八氢番茄红素去饱和酶的催化作 用受阻，从而影响类胡萝卜素的生物合成。类胡萝卜素既可作为光吸收体，又可作为保护性物 质，降低三线态叶绿体或单线态氧的激发，类胡萝卜素的生物合成被抑制将导致植物最终死 亡。这样HPPD抑制剂同时又起着八氢番茄红素去饱和酶抑制剂的角色，是一类很有前途的 除草剂。

早在1985年就有报道指出，HPPD可能是开发除草剂新品种的新靶标；1992年发现， 三酮类化合物是HPPD的潜在抑制剂；到目前为止，除了80年代开发的吡唑类品种外，新近又 开发出若干广谱高活性新品种，即三酮类的磺草酮与甲基磺草酮以及异恶唑类的百农思。 这表明，HPPD作为靶标，涉及的化合物类型不断增多，成为今后开发除草剂新品种的重要领 域之一。目前，已经商业化的HPPD抑制型除草剂主要属于四个化学家族：三酮类（例如磺草 酮、甲基磺草酮）、二酮腈类、异噁唑类（例如异噁氟草）、吡唑类（例如吡唑特、吡草酮和苄草 唑）。

目前，HPPD抑制剂型除草剂被广泛应用到对其具有代谢耐受性的植物中（例如玉 米可迅速代谢掉HPPD抑制剂），用以防治杂草。为了能扩大HPPD抑制剂型除草剂的应用范 围，迫切需要对植物（特别是没有代谢耐受性的植物）进行改造，以赋予其对HPPD抑制剂的 耐受性。

已有很多报道通过向植物中转入外源的HPPD抑制剂抗性基因以赋予植物对HPPD 抑制剂的耐受性，例如，Dufourmantel等人将假单胞菌属的HPPD抑制剂抗性基因转入烟草 和大豆中，获得了对异恶唑草酮的耐受性（DuDufourmantel等人，2007，PlantBiotechnol J.5(1):118-33）。

在WO99/24585中，公开了一个突变的HPPD核苷酸序列及其获得对某些HPPD抑制剂 具有耐受性的植物。

为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需 要新的HPPD抑制剂抗性基因和以此为基础的抗HPPD抑制剂转基因植物。

本发明所提供的新的HPPD抑制剂抗性基因，是发明人用PCR的方法从发明人筛选 的高HPPD抑制剂抗性菌株中克隆得到。本发明进一步在拟南芥、水稻、玉米等植物中证明了 这个HPPD抑制剂抗性基因的抗HPPD抑制剂能力及其在发展转基因抗HPPD抑制剂农作物中 的用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供新的使植物具有HPPD抑制剂抗性的基因及 其编码蛋白。另外，本发明还提供了这个基因的基因工程中间体（如表达盒、载体和细胞 等），获得具有HPPD抑制剂抗性的植物的方法和应用，并提供了判断植物是否具有HPPD抑制 剂抗性的鉴定方法。