[发明专利]一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法

说明书

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法。本发明在重组木糖利用酿酒酵母菌株中用多拷贝游离型质粒pRS425K以启动子过表达酿酒酵母内源基因ZWF1，得到能够提高木糖、葡萄糖同步共利用中木糖比例的重组酿酒酵母菌株。本发明分子操作简单，无需通过长期的进化过程，就可以初步实现木糖、葡萄糖的同步共利用。

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法。

背景技术

液体燃料方便运输和便于利用，已成为重要的工业和日常能量来源。其中，石油是目前全球使用最多的液体燃料，但是，石油资源不可再生且CO₂和其他污染气体的排放会导致环境的恶化。发展可再生的清洁能源成为我国的能源发展战略的重中之重。乙醇作为可替代的清洁液体能源受到广泛的关注，传统生产乙醇的方法是以粮食为原料，采用酵母直接发酵的产生乙醇，但此种方法需要消耗大量的粮食，这与我国生物质能源发展坚持“不与人争粮不与粮争地”的原则相违背。农业废弃物逐渐进入人们的视线，如玉米秸秆，高粱秸秆，小麦秸秆等，农业废弃物也是碳水化合物，并且每年产量巨大，这些废弃物得不到有效利用便会被农民烧掉，不仅浪费能源而且污染环境。利用农业废弃物即木质纤维素经过预处理后经过酶解得到的葡萄糖和木糖可以被酵母菌所利用产生乙醇，采用这种方法既保护了环境，又能有效利用资源，得到清洁能源，是非常有意义的能源利用方式。

但目前，制约木质纤维素发展的瓶颈是重组酵母对木糖的利用，经预处理后的木质纤维素水解物中有约30％为木糖，天然的酿酒酵母不能利用木糖，体内直接整合或者以质粒形式表达的木糖代谢途径的酿酒酵母如未经驯化则利用木糖的速度缓慢，而且明显存在葡萄糖阻遏问题，即培养基中如果存在葡萄糖，则葡萄糖会被优先利用，木糖几乎不被利用，只有葡萄糖耗尽后，木糖才开始被利用。这就大大延长了发酵周期，降低了纤维素乙醇的生产效率。因此，开发能够高效同步共利用木糖、葡萄糖的酿酒酵母菌株显得尤为重要。

现有的构建木糖利用酿酒酵母的方法有：在酵母染色体上整合木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径或者木糖异构酶(XI)途径，再者，就是构建质粒形式的上述途径。

在这些构建方法中，表达(XR-XDH)途径过程中由于XR及XDH两种酶辅因子偏好性不同，XR是NADPH依赖型，而XDH需要大量的NAD⁺，这就造成了酵母细胞内辅因子的不平衡，以致木糖醇大量积累，降低了木糖的利用率。而表达(XI)途径的菌株通常由于受到该酶活性的限制，利用木糖的速度相对缓慢。而且通过基因工程得到的木糖利用重组酵母菌株在发酵过程中往往会存在严重的葡萄糖阻遏现象，不能满足纤维素乙醇的工业化生产的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法。本发明提供的一种提高木糖利用酿酒酵母木糖、葡萄糖同步共利用中木糖比例的方法，本发明的方法无需通过进化工程，分子操作简单，构建目的菌株所需时间较短，能够克服葡萄糖代谢阻遏，在混糖发酵时实现葡萄糖存在下木糖、葡萄糖消耗比例达到1/8。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组酿酒酵母菌株，过表达酿酒酵母内源基因ZWF1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述内源基因为酿酒酵母L2612内源

基因ZWF1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株选用启动子将内源基因ZWF1通过表达载体在底盘菌株中过表达。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株所述底盘菌株为重组酿酒酵母SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3；RPE1::TRP1)或重组酿酒酵母SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)。