[发明专利]玉米转录因子ZmMADS47基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米转录因子ZmMADS47基因及其应用。

技术背景

玉米（Zeamays）是世界上种植面积最大并且产量最高的禾本科作物之一，大多用于动物饲料，食物以及工业原料，在工农业中均有着广泛的应用。玉米对于现代社会的发展起到了重要作用。但玉米蛋白质中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的储藏蛋白醇溶蛋白中赖氨酸和色氨酸严重缺乏。有研究表明，低含量的醇溶蛋白以及粉质的胚乳会增加非醇溶蛋白的积累，从而显著改善玉米籽粒中蛋白质的营养品质。

Opaque2(O2)是一个含有bZIP结构域的转录因子。在生化成分中，o2突变体籽粒相对野生型表现出了粉质的胚乳以及低含量的醇溶蛋白，因此其赖氨酸和色氨酸积累量较野生型有大幅提高。所以，o2是一个著名的籽粒高赖氨酸突变体。目前研究表明，转录因子Opaque2可以调控绝大部分醇溶蛋白的表达。从O2克隆至今，人们找到了一些和O2互作的蛋白，如：PBF、OHP1/OHP2、GCN5，ZmTaxilin等。但是对于O2在玉米籽粒发育中具体的调控机制依然未得到完全解析。

鉴于O2本身转录因子的分子结构以及其调控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人们普遍认为O2是一个在籽粒发育中起到重要作用的转录因子。寻找其他与O2互作的蛋白从而进一步解释醇溶蛋白调控网络对于人们改进玉米蛋白品质具有极为重要的意义。一般来讲，研究蛋白互作的方法包括酵母双杂，Pull-down以及免疫共沉淀（coIP）等实验。

酵母双杂实验是基于酵母体系筛潜在互作蛋白的方法。该实验可以大范围地筛选出可能存在直接互作的两个蛋白。但其背景信号较高，会有一些假阳性情况出现。

Pull-down与免疫共沉淀是基于免疫沉淀和Western技术发展来的体外以及体内检测蛋白互作的技术。该技术通过抗体的特异性吸附以及互作蛋白之间的相互物理性结合来进行互作验证。该实验方法相对于酵母双杂可以大幅降低背景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种玉米转录因子ZmMADS47基因。

本发明的目的之二在于提供玉米转录因子ZmMADS47基因的应用。

为达到上述目的，本发明具体涉及到的方面为：

一种玉米转录因子ZmMADS47基因，其特征在于所述基因为SEQIDNO:1所示的碱基序列。

一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的玉米转录因子ZmMADS47基因。

一种质粒，其特征在于该载体含有根据权利要求2所述的载体。

一种克隆上述的玉米转录因子ZmMADS47基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：首先获得均一化的玉米籽粒cDNA片段，将该cDNA片段与双杂载体pGADT7-Rec连接转化，获得了约1.0×10⁶个克隆，选取了包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域的O2-2片段，将其连入pGBK-T7载体中，通过PEG/LiAc法将构建的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到10⁶个酵母转化子，通过DDO与QDO的筛选，共获得了50个疑似阳性克隆，对这些克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与水稻OsMADS47同源的基因ZmMADS47。

一种上述的玉米转录因子ZmMADS47基因与Opaque2基因相互作用在RNAi转基因沉默过程中的应用。

一种上述的玉米转录因子ZmMADS47基因与Opaque2基因相互作用在下调玉米种19kD醇溶蛋白，22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白含量中的应用。

通过Pull-down和coIP实验明确了ZmMADS47和O2在体外和体内都能相互作用。

通过醇溶蛋白抽提实验以及对醇溶蛋白基因的定量PCR实验证明了该基因在转基因沉默后会导致19kD醇溶蛋白、22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白的表达下降。

本发明通过RNA干扰的方法获得一个O2互作蛋白ZmMADS47的基因沉默转基因玉米材料，并通过醇溶蛋白抽提，透射电镜观察等对转基因材料进行表型分析。通过透射电镜观察证明了该基因在转基因沉默后会导致细胞内蛋白体体积变小并且不规则。

本发明首次发现植物MIKC类的MADS-box转录因子ZmMADS47能够和bZIP类的转录因子O2发生互作，并且能够影响醇溶蛋白表达，在细胞学上对蛋白体的形状产生影响。为高品质玉米的大规模生产奠定理论基础。