[发明专利]一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明是申请号为201510435866.X、申请日为2015年7月22日、发明名称为“一种 郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法”的专利的分案申请。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒及检测方法。

背景技术

郁金香是国际名花之一，以高贵、典雅为世界人民所宠爱，是欧亚等地区近20个国 家的国花。近年来，我国各地相继举办了郁金香花展，获得了较好的效益。虽然郁金香在我 国很早就有少量栽培，但大部分仍从荷兰等国家进口。20世纪80年代中后期以来，我国从国 外引进郁金香商品种球数量逐年成倍增长，其携带的一些有害生物也随之传入，包括真菌、 细菌、线虫和病毒等，潜在危害性很大。郁金香碎色病是种球常见感染之一，其造成种球退 化，严重影响了郁金香的生产。

引起郁金香碎色病的病原体是郁金香碎色病毒(Tulipabreakingvirus,TuBV)， 病毒粒子大小为700nm×(12-13)nm。感染TuBV的主要症状是叶片出现浅绿色或灰白色条 斑，有时形成花叶，在红花和紫花品种上产生碎色花，花瓣上形成大小不等浅色斑点或条 斑，严重时植株生长不良，还可危害百合类花卉。

目前检测郁金香病毒多使用抗血清的ELISA法或RT-PCR法，然而这两种方法均存 在不足：ELISA法须制作抗血清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而RT-PCR灵敏 度和特异性不高。因此，有必要开发一种快速、准确的TuBV检测方法，以满足产业需求。

环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH, YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplification ofDNA.NucleicAcidsRes.2000Jun15；28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板的 热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且 无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。

逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度 是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使 RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、BstDNA聚合酶和核酸染料，其中所述 引物的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDNO:1)

外引物B3：CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDNO:2)

内引物FIP：CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT

GTTAAATCTGGAGTGT(SEQIDNO:3)

内引物BIP：ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC

AACTGCTCG(SEQIDNO:4)。

优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和所 述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。

优选地，所述反应缓冲液由10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mMMgSO₄组成。

优选地，所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/μl。

优选地，所述核酸染料为SYBRGreenI。

优选地，本发明的试剂盒进一步包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。

在另一个方面中，本发明还提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其包括以 下步骤：