[发明专利]一种黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：

(1)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片的制备:

将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X10⁵个/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时；此时细胞基本铺满孔底，再用黄热病毒NS1蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染；用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行；细胞转染48小时后，得到表达的黄热病毒NS1蛋白，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存；所用的黄热病毒为病毒株AEQ35299；

(2)样品稀释液和洗液的配置；

(3)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片的平衡：将表达有黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟；

(4)加入待测样品、阳性对照、阴性对照；所述的阳性对照为抗黄热病毒NS1蛋白的兔阳性血清，其制备包括如下步骤：将表达黄热病毒毒株AEQ35299蛋白的全长基因经分子克隆的方法克隆到Inerator^TM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗血清，经间接ELISA的方法检测抗血清的效价，效价检测>1:64000后进行加强免疫，二次免疫间隔3周后，10天之后收集抗血清；所述的阴性对照为未免疫新西兰大白兔,制备过程同阳性对照；

(5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次；

(6)加入荧光标记二抗；

(7)吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍；

(8)结果判定：将载玻片Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有黄热病毒抗体。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的稀释液成分为5％山羊血清溶于0.01M的磷酸盐缓冲液PBS中，所述的洗液成分为0.05％吐温20溶于0.01M磷酸盐缓冲液中。

3.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(4)所述阳性对照用稀释液1：100稀释，阴性对照用稀释液1：100稀释。

4.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(4)所述的待测样品、阳性对照、阴性对照，每孔加入200ul，盖上ChamberSlide盖子，室温放置60分钟。

5.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的荧光标记二抗为羊抗兔与羊抗人二抗混合液。

6.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的荧光二抗混合液加入前用样品稀释液1:2000倍稀释。

7.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的荧光二抗每孔加入200ul，室温避光放置1小时，此步骤之后做避光处理。

8.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：与在载玻片外进行与步骤(1)同步的黄热病毒NS1蛋白制备与纯化验证实验，包括如下过程：

将Expi293F^TM细胞在Expi293F^TM表达培养基中进行悬浮培养，待细胞浓度增长到合适浓度时进行细胞转染实验；细胞使用ExpiFectamine^TM293转染试剂进行细胞转染；以30ml的培养体系进行转染时，取两个1.5ml的离心管A/B，A管中加入RPMI1640细胞培养液、病毒株AEQ35299 DNA 30ug，总体积1.5ml，轻柔混匀；B管中加入RPMI1640细胞培养液、ExpiFectamine^TM转染试剂80ul，总体积1.5ml，轻柔混匀，室温孵育5分钟后，把A加入B中，轻柔混匀，室温孵育20分钟加入细胞中；在转染后96小时左右后收集蛋白；在蛋白制备过程中无需改变培养基或添加培养基，收集的细胞上清经Ni柱纯化，得到表达的黄热病毒NS1蛋白。