[发明专利]一种马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。

背景介绍

随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。近年来,烈性病毒性传染病在世界各国频频暴发流行,对人类健康带来严重威胁,给社会造成巨大经济损失。这些烈性病毒性传染病的频发给我们敲响了警钟,加强对其的研究和监测以及早预防控制是至关重要的。

马秋波病毒(Machupo Virus)是一种沙粒病毒。1962年首次在玻利维亚发现，该病毒由老鼠携带。染病初期表现为发烧，然后鼻子和牙龈开始出血，胃肠内出血，30％的感染者会死亡。病毒体积小但威力大。一个健康细胞的细胞核中携带着遗传物质——基因，病毒攻击的目标正是这些基因。病毒将自己的DNA注入细胞基因中，使它们复制更多的病毒。病毒侵入细胞的方式非常复杂，但病毒是一种寄生生物，一旦这些新制造出来的病毒离开宿主，它们就必须尽快找到新的宿主，否则就会灭绝。世界上六种神秘病毒最致命，马秋波病毒是其中之一。

马秋波病毒在我国尚未流行,但随着我国商贸、旅游业的快速发展,境内外人员交往日益密切,以及动物的进口等影响,烈性病毒输入的危险性日益增高，因此,尽快建立快速简便、特异敏感的检测方法防范马秋波病毒输入并控制其暴发流行具有重要意义。对马秋波病毒的检测技术的国内目前研究不多，目前已知的相关研究是中国检验检疫科学研究院的姚李四等人通过荧光定量PCR检测方法检测病毒及通过大肠杆菌表达系统马秋波病毒目的蛋白继而通过免疫方法对病毒进行检测，这两种检测方法均不够简便、快速。本发明提供的IgG抗体间接免疫荧光法可检测人抗马秋波病毒糖蛋白抗体，为马秋波病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法，本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，最大限度地防止外来输入性传染病的发生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。本发明的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，包括如下步骤：

1.表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的制备:

将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X10⁵个/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时。此时细胞基本铺满孔底，再用马秋波病毒糖蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染。用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行。细胞转染48小时后，得到表达的马秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存。

2.样品稀释液和洗液的配置；

3.表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟。

4.加入待测样品、阳性对照、阴性对照：每孔加入200ul，盖上Chamber Slide盖子，室温放置60分钟。

5.吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次。

6.加入荧光标记二抗：每孔加入200ul，室温避光放置1小时，此步骤之后均需做避光处理，防止荧光衰退。

7.吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍。

8.结果判定：将Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有马秋波病毒抗体。

步骤1所述的马秋波病毒为病毒株MARU 249121；

步骤2所述的样品稀释液为5％山羊血清溶于0.01M PBS缓冲液中；洗液为0.05％的吐温20溶于0.01M PBS缓冲液中。