[发明专利]原花青素的应用及含原花青素的凝血酶时间测定试剂

说明书

技术领域

本发明涉及原花青素在凝血酶试剂中的应用，以及一种含有原花青素稳定剂的凝血酶时间测定试剂及其制备方法。

背景技术

用于测定凝血酶时间(TT)的试剂，其中的活性组份为凝血酶。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶(CrawleyJT，Thecentralroleofthrombininhemostasis.JThrombosisHaemostasis2007,5(suppl1):95–101；McMichaelM.,Newmodelsofhemostasis.TopicsinCompanionAnimalMedicine,2012,27:40–45)。作为活性凝血因子II，它的活性受很多因素的影响，特别是在液相或乳浊相中。为了维系凝血酶的活性，可添加低浓度的盐类和醇类(USPatent4696812)；BSA和EDTA(USPatent4409334)；氨基酸类和有机酸及多糖类(特願平11/272092トロンビンの安定化手段および組成物；USPatent20060246052A1)。含有上述稳定剂的液相凝血酶制剂，经冷冻干燥制成粉剂后，凝血酶的活性得到较好的保护。另一方面，根据实验研究，上述添加剂对液态或乳浊相中的凝血酶的稳定效果并不尽理想，特别是在试剂存放较长时间的条件下。这是由于液态状态下，凝血酶的结构相对粉末态比较脆弱，酸、碱、温度、离子强度以及其它某些化合物(包括重价金属离子)的少量存在，都会引起凝血酶空间结构的改变，局部结构的微小变化也会引起凝血酶活性的丧失。

作为多酚类，黄酮可用于抗菌(Cushnie,T.,Lamb,A.Antimicrobialactivityofflavonoids.InternationalJournalofAntimicrobialAgents2005,26,343-356)，以及抑制肿瘤生长(Ferguson,P.J.,Kurowska,E.M.,Freeman,D.J.Invivoinhibitionofgrowthofhumantumorlinesbyflavonoidfractionsfromcranberryextract,NutritionandCancer2006,56,8694)，而更多的研究则倾向于它的抗氧化性能(VanAcker,S.A.B.E.,Structuralaspectsofantioxidantactivityofflavonoids,FreeRadicalBiologyandMedicine1996,20,331-342.；DeSouza,R.F.,Antioxidantpropertiesofcomplexesofflavonoidswithmetalions,RedoxReport2004,9,97-104.；TeixeiraS.,Structure-propertystudiesontheantioxidantactivityofflavonoidspresentindiet.FreeRadicalBiologyandMedicine2005,39,1099-1108)。

有研究表明，在含有凝血酶的体系中加入黄酮，凝血酶的活性会受到抑制(HugoA.Guglielmone,AnticoagulanteffectandactionmechanismofsulphatedflavonoidsfromFlaveriabidentis,ThrombosisResearch,2002,2：183–188；LiuL,MaH,YangN，Aseriesofnaturalflavonoidsasthrombininhibitors:structure-activityrelationships.ThrombosisResearsh,2010,126:365–378)。但是，黄酮包含多个亚类，它具有较好的抗氧化性，也具有很强的金属离子螯合能力，从而可以降低二价金属离子对物相氧化反应的催化作用(VanAcker,Influenceofironchelationontheantioxidantactivityofflavonoids.Biochem.Pharmacol.1998,56:935-943)。基于上述思路，我们发现并不是所有的黄酮都能够抑制凝血酶的活性，而属于黄酮类的原花青素，不仅不会影响凝血酶的酰胺反应和蛋白反应，同时还会提升含有凝血酶的液相体系的稳定性能。