[发明专利]麻痹性贝毒快速检测胶体金试纸条及其制法

说明书

技术领域

本发明用于赤潮毒素的检测，主要包括的赤潮毒素为一种麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poisoning，PSP）的快速检测试纸条，以及包括试纸条制法。

背景技术

麻痹性贝毒是我国近岸海域常见的贝毒种类之一，在近岸海域贝类体内常可检出，已严重影响了贝类出口贸易，引起了各级政府及研究领域的极大关注。建立麻痹性贝毒的快速灵敏准确的检测方法和产品，对确保海产品食用安全和维持水产养殖经济健康可持续发展具有十分重要的意义。目前已知有麻痹性贝毒检测试纸，主要检测麻痹性贝毒组分为STX、dcSTX、GTX5、GTX2/3、dcGTX2/3、C1/C2，检测灵敏度为110ng/mL，室温下可保存6个月。

发明内容

本发明的目的是提供一种麻痹性贝毒快速检测胶体金试纸条及其制法，将抗麻痹性贝毒单克隆抗体用胶体金标记，包被在胶金垫上，将石房蛤毒素STX与蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠抗体(多抗或单抗)构成的质控线包被在赛多利斯NC膜上。以此来实现麻痹性贝毒胶体金试纸条的研制，并用于麻痹性贝毒的快速检测。

本发明的技术方案是这样实现的：麻痹性贝毒快速检测胶体金试纸条，样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上，所述胶金垫包被有抗麻痹性贝毒单克隆抗体-胶体金标记物，所述NC膜上分别包被有石房蛤毒素-卵清蛋白偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠单抗的质控线。试纸条外包装试纸条卡，试纸条卡上面开有加样孔和显色区。

麻痹性贝毒快速检测胶体金试纸条的制法，步骤如下：

1）将石房蛤毒素STX与血蓝蛋白KLH或卵清蛋白OVA偶联，制备得到STX-KLH和STX-OVA偶联物，备用；

2）用STX-KLH偶联物免疫Balb/C小鼠，经细胞融合，经HAT选择性培养，获得分泌抗麻痹性贝毒单克隆抗体的杂交瘤阳性细胞系；

3）制备抗麻痹性贝毒单克隆抗体；

4）制备免疫胶体金：将步骤3）制备的抗体加入到胶体金中得到标记物，用喷点仪包被到经预处理的胶金垫上；

5）将STX-OVA偶联物喷点在NC膜上构成检测线，并将羊抗鼠单抗喷点在NC膜上构成质控线；

6）将样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上，安装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。阳性100ng/mL完全抑制，无条带出现；加样量为80μl/孔；判断时间为小于10min；最低检测限为小于100ng/ml。真空封装，常温保存，有效期大于12个月。

本发明的有益效果为：本发明提高了检测灵敏度，延长了保存有效期。而提高灵敏度，可提高贝类体内麻痹性贝毒的检出率，含量较低的麻痹性贝毒仍可检出，对于水产品的食用安全问题具有重要意义；而延长了保存有效期，对于该试纸条日后的推广，降低失效的可能。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。

1、麻痹性贝毒完全抗原的获得。将石房蛤毒素(STX)溶于0.002M的乙酸钠缓冲液中，加入溶于PBS( pH7.0)缓冲液的血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)及少量甲醛，25℃反应72小时，再4℃过夜。将反应混合物透析3d，4℃，每12h换液1次。制备得到STX-KLH和STX-OVA偶联物即两种麻痹性贝毒完全抗原，备用。

2、麻痹性贝毒单克隆阳性细胞株的获得。用STX-KLH偶联物免疫Balb/C小鼠，免疫6次后杀鼠取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经HAT选择性培养，获得分泌抗麻痹性贝毒单克隆抗体的杂交瘤阳性细胞系。

3、制备抗麻痹性贝毒单克隆抗体；分泌抗麻痹性贝毒(PSP)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。取8周龄健康Balb/C雌性小鼠或杂交一代鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/每只，待用。1500r/min离心收集对数生长期的阳性杂交瘤细胞，悬浮于生理盐水中，浓度为10⁶/ml。在石蜡油处理的小鼠腹腔内注射0.5ml杂交瘤细胞悬液诱生腹水，收集腹水，3000r/min离心10min，收集上清液即为含单克隆抗体腹水。腹水用优化的辛酸硫酸氨纯化方法得到粗制抗体蛋白，再用0.01M的PBS缓冲液(pH7.4)透析3天。取出用紫外分光光度计测得蛋白浓度为8.0mg/ml。