[发明专利]一种调控产长链二元酸的基因及其应用

权利要求书

1.一种长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p表达的长链脂肪酸转运蛋白Pxa1p，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.权利要求1所述长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p在生产长链二元酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因工程手段对热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p进行基因敲除，构建热带假丝酵母基因工程重组菌，再利用热带假丝酵母基因工程重组菌发酵生产长链二元酸。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述热带假丝酵母基因工程重组菌的发酵，步骤如下：

将热带假丝酵母基因工程重组菌种子液接种于发酵培养基中，28～32℃条件下培养12～14小时，然后调pH至7.0～8.0，接入油脂或烷烃进入产酸期发酵，维持pH7.0～8.0，每10～14小时流加葡萄糖溶液至发酵液中葡萄糖浓度为2.5～20g/L，发酵产酸4～5天，即得；

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖40～60g/L、(NH₄)₂SO₄0.5～1g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏1～2g/L、VB₁0.1～0.2g/L、NaCl1～2g/L、KH₂PO₄4～8g/L、Na₂HPO₄·12H₂O5～10.08g/L、尿素2～3g/L、Mg₂SO₄·7H₂O5～6.15g/L、吐温600.02～0.5g/L、泡敌3g/L，水配制，pH6.0～7.0。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述热带假丝酵母基因工程重组菌种子液采用如下方法制备：

将热带假丝酵母基因工程重组菌接种于种子培养基中，28～32℃、200～250rpm条件下培养14～16小时，制得热带假丝酵母基因工程重组菌种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉5～10g/L、蛋白胨10～20g/L、葡糖糖20～30g/L，水配制，pH自然；

优选的，所述调pH的pH调节剂为氢氧化钠。

7.权利要求3所述热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取热带假丝酵母菌体的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物Pxa1p1-up和Pax1p1-down进行PCR扩增，制备用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1；

所述的PCR引物核苷酸序列如下：

Pxa1p1-up:GGAATTCCCTGCTTCTTATACCAATGCC

Pax1p1-down:ACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCAC

(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，使用引物Kan-up和Kan-down进行PCR扩增，得到G418抗性基因片段Kan；

所述的PCR引物序列如下：

Kan-up:GTGCTTAAATATACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTG

Kan-down:CTTGCCGGGTCTTCTTTAGGGAATTCACTTGA

(3)将步骤(1)制得的用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1与步骤(2)制得的G418抗性基因片段Kan进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan片段；

(4)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，使用引物Pxa1p2-up和Pax2p2-down进行PCR扩增，得到同源臂pxa1p2；

Pxa1p2-up:TCACTGTCCGACTTCAAGTGAATTCCCTAAAGAAGACC

Pax2p2-down:TTGATCACGCAAACTTCC

(5)将步骤(3)制得的pxa1p1-kan片段与步骤(4)制得的同源臂pxa1p2进行重叠PCR，制得pxa1p1-kan-pxa1p2片段；

(6)将步骤(5)制得的pxa1p1-kan-pxa1p2片段经限制性内切酶EcoRI酶切，转化热带假丝酵母，经筛选，制得热带假丝酵母基因工程重组菌。