[发明专利]一种海洋细菌耐药基因检测芯片及其应用

说明书

本发明目的是提供一种海洋细菌耐药基因检测芯片，可对海水环境细菌中针对5大类抗生素的32种耐药基因进行高通量快速检测。本发明所提供的检测芯片，是在芯片载体上固定有用于检测海洋细菌耐药基因的探针；所述的耐药基因包含有四环素类耐药基因、磺胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、β‑内酰胺类耐药基因、氯霉素类耐药基因。本发明的芯片可用于海水养殖环境细菌耐药谱的快速检测和筛查，也能快速准确地检测出海水养殖动物病原菌携带的相关抗生素耐药基因。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种海洋细菌耐药基因检测芯片及其应用。

背景技术

中国是世界上最大的海产品生产和消费国，每年的养殖海产产量达155万吨，占全球养殖产量的80％。但随着海水养殖产业的发展，海水养殖动物经常遭受到一些传染病的危害，其中细菌是引起养殖动物病害发生的主要因素之一。从抗生素应用开始，人们倾向于利用抗生素类药物预防或治疗细菌性传染病，但有研究证明由于大部分的抗生素很难为动物吸收利用，大约有30-75％的抗生素以母体化合物形式随粪尿排出体外。因此直接加到水体用于治疗或预防病害的、未被水产养殖生物吸收的，和随粪便排泄的抗生素可能聚积于水体及底泥沉积物中造成污染。另外，近海养殖环境靠近陆地，工业、城市生活废水中的残留抗生素也直接流入养殖水体或经地下水间接污染养殖水域。在陆源污染和近海水产养殖大量施用抗生素的双重压力下，近海水环境容载了目前人类发现的所有抗生素。由于抗生素的广泛和不合理使用，近海海洋环境中的耐药菌变得司空见惯，多重耐药菌也不断被发现。这些抗生素耐药菌通常携带有一种或多种抗生素耐药基因，耐药基因也可以从非致病性细菌转移到病原菌中或随着食物链的传递转移到人或其他动物体内。作为一个生态和环境问题，这些海水养殖环境中的耐药菌及其携带的耐药基因构成的抗生素耐药基因库，不仅会直接对海水养殖动物和人类生命健康造成危害，而且对海洋生态环境平衡也存在威胁。环境中耐药菌作为潜在的耐药基因库也在近年来被人们加以重视和研究。

在目前发现的抗生素中，四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类和氟苯尼考类抗生素药物均被水产为养殖允许使用且使用量较多的抗生素药物，海水环境中也存在相当数量的针对这5类抗生素药物的耐药菌。这些耐药菌通常携带有一种或多种具有相同或不同耐药机制的耐药基因，例如介导药物靶位点改变机制基因dfrA1、dfrA12、sul1、sul2，介导抗生素外排机制基因cmle1、cmle3、tetA、tetB、tetC、tetG，介导药物靶位点保护机制基因tetM、tetS、qnrA、qnrS，介导药物活性位点失活的耐药基因cata1、cata2、bla-TEM、bla-SHV、bla-VIM等。目前，研究者已开始针对这些问题开展了一系列的研究以监测环境中耐药菌和耐药基因、揭示可以介导耐药基因转移的可移动片段的分子结构及功能机制。但是这其中的大部分研究只关注感染人类的耐药性病原菌及其耐药基因，对于养殖业中抗生素耐药菌及耐药基因的研究大多侧重于畜禽类及淡水水产养殖环境中针对于一种或多种抗生素药物的耐药基因的定性和定量检出，而针对于海水水产养殖环境中耐药菌及耐药基因的研究较少。由于海洋水产养殖环境中细菌种群结构以及养殖过程中药物使用习惯有别于畜禽类及淡水水产养殖，相关研究并不能反映海水养殖环境耐药基因分布状况。目前对海水养殖区抗性菌及耐药基因的研究方面，Jun等在韩国海水养殖区检测到多种tet基因，Dalsgaard等在泰国海水养殖区检测到氨基糖苷、β-内酰胺磺胺类及四环素类耐药基因。但在中国北方部分海域养殖区仅有检测到cat I,II,III,IV基因和tetA,B,D,E,M基因的报道，如山东胶州湾区域分离菌中定性检测到tet、cat、floR基因，而其他海水养殖区采样点并无其他研究。此外相关研究中细菌耐药性检测主要使用药敏试验，其优点在于方便、简捷、易判定，但只能对少量样品进行一对一检测分析。由于环境中可分离培养细菌仅占环境细菌的1-5％左右，药敏实验无法反映出细菌耐药的来源和传播机制。对于环境中抗生素耐药基因检测的方法还有质粒图谱、PCR-单链构象多态性、质粒指纹图谱、PCR及PCR-限制性片段长度多态性、核酸探针检测、DNA序列测定等，这些研究方法，弥补了药敏试验的不足，但这些技术往往只限制于单一耐药基因的的检测，要对细菌众多的耐药基因进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。