[发明专利]佛司可林在制备诱导家蚕卵滞育药物中的应用

说明书

本发明涉及一种佛司可林（Forskolin）的新用途。本发明内容包括：用佛司可林注射非滞育的家蚕二化性品种（大造）有效诱导产出滞育卵的方法；佛司可林作为腺苷酸环化酶的激活剂，激活了家蚕CREB的表达。本发明揭示了佛司可林可以在幼虫阶段通过提高CREB的表达诱导家蚕卵的滞育性改变。

技术领域

本发明涉及一种佛司可林（Forskolin）的新用途。

背景技术

佛司可林是一种分离自印度植物Coleus forskohlii的天然二萜产物，通过激活腺苷酸环化酶使细胞受体敏感化，提高cAMP在细胞内的水平。CREB (cAMP responseelement binding protein) 作为真核生物中重要而又相当保守的转录调控因子，与cAMP应答元件结合，调节被cAMP诱导的基因表达，产生多种多样的生理功能。我们的研究表明，产滞育卵的家蚕中CREB的表达量比产非滞育卵的高。为此，我们利用腺苷酸环化酶的激活剂佛司可林，在产非滞育卵的家蚕幼虫期注射，调查家蚕卵滞育性的改变和CREB表达量的变化。

发明内容

本发明的目的在于提供佛司可林在制备诱导家蚕卵滞育药物中的应用。本发明内容包括：用佛司可林注射非滞育的家蚕二化性品种（大造）有效诱导产出滞育卵的方法；佛司可林作为腺苷酸环化酶的激活剂，激活了家蚕CREB的表达。本发明揭示了佛司可林可以在幼虫阶段通过提高CREB的表达诱导家蚕卵的滞育性改变。

附图说明

图1为注射后第二天家蚕脂肪中CREB表达量的变化。图A：Western blot结果；图B：A图灰度分析结果，用CREB/Actin的相对比值表示。

具体实施方式

本发明的具体步骤为：

（1）滞育性家蚕与非滞育性家蚕

本发明利用二化性品种大造，该品种的蚕卵放在15℃、持续黑暗下孵化，为非滞育性家蚕，化蛾后所产卵都为非滞育卵；而该品种的蚕卵放在25℃、持续光照下孵化，为滞育性家蚕，化蛾后所产卵都为滞育卵。本发明利用15℃、持续黑暗下孵化的（大造）家蚕，其预定所产卵都为非滞育卵。

（2）佛司可林试剂配制

佛司可林粉末为Sigma公司进口分装，放-20℃保存。使用前用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成5 ug/uL储存液，再用蒸馏水稀释为0.02 ug/uL的工作液。

（3）佛司可林注射家蚕

非滞育性雌蚕五龄蜕皮后第二天放置冰上麻醉30分钟，用玻璃毛细管从家蚕腹足基部注射佛司可林工作液（0.02 ug/uL）2uL，对照注射2%的DMSO 2 uL，用桑叶继续饲养，直至吐丝结茧，化蛾后正常交配产卵。

（4）家蚕卵滞育性调查

家蚕交配产卵后放在25℃保存，10天后观察卵的孵化情况。若卵孵化则为非滞育卵，若卵为褐色且未孵化则为滞育卵。调查结果见表1。

（5）家蚕CREB的检测

解剖取样与蛋白质抽提

将注射后的家蚕桑叶饲养2天后，放置冰上麻醉30分钟后解剖取家蚕中肠和脂肪，加入300 uL 蛋白抽提液，用研磨器碾碎；冷冻离心机4℃、12000 rpm离心 30min取上清；

②上清蛋白质的定量