[发明专利]一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）灭活病毒悬液制备

采用禽流感病毒稀释液稀释禽流感病毒至5000-10000倍，接种9-10日龄鸡胚，0.1- 0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液， 既得禽流感病毒混合病毒液；

2）禽流感复合灭活疫苗制备

将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭 活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的禽流感病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混 合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭 活疫苗。

2.如权利要求1所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤 1）中禽流感病毒稀释液为每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合5 ～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮 氨酸和抗坏血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得 到。

3.如权利要求1所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤 2）中每份免疫增强剂含有中药黄酮10～30g、卵黄抗体6～10g和法氏囊素5～15mg。

4.如权利要求2所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的氨基 酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～ 60%和抗坏血酸10～30%。

5.如权利要求2所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的复方 中药黄酮按以下步骤制得：

a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和 夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯 化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进 行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到复 方中药黄酮。

6.如权利要求2所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的脂质 体通过以下步骤制得：按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆 酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制 pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质 体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。

7.如权利要求3所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药 黄酮通过以下步骤制得：

a、按金钱草10～30份，穿心莲10～30份，地锦草20～40份，金银花10～20份，白头翁10 ～30份，半边莲10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量 15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进 行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中 药黄酮。