[发明专利]一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失 减毒疫苗的方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起皮肤 病和性病的常见病原体，HSV-1最常见的感染部位是口腔和唇，HSV-2主要通过性传播。美 国每年有生殖器疱疹5万多例，70多万孕妇为预防胎儿经产道感染HSV而被迫施行剖宫产分 娩。据WHO估计，每年生殖器疱疹的新发病例约2000万。临床上80%HSV感染者表现为无症状 感染或症状未被识别，这是造成HSV感染流行的重要因素。

尽管现有的抗病毒药物应用能缩短生殖器疱疹感染的病程，并且其治疗复发性感 染具有一定的效果，但这些抗病毒药物不能有效预防疱疹病毒原发感染以及控制疱疹病毒 潜伏感染和复发性感染。研制和接种HSV疫苗是预防该病毒感染的理想方法。

动物实验的结果显示，HSV疫苗能预防病毒原发感染，并能有效地控制复发性生殖 器疱疹感染。目前HSV疫苗的研制日益受到人们的重视，研究较多的HSV疫苗主要有灭活病 毒疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、复制受限疫苗、活载体疫苗以及DNA疫苗等。

早期的灭活病毒疫苗是利用加热、化学处理、紫外线照射等方法将接种在鸡胚中 的HSV病毒灭活制备疫苗。现在的灭活疫苗是将在细胞中培养的病毒灭活并经过一系列的 纯化过程制成的。但灭活疫苗存在免疫原性弱、不能诱导机体产生广泛持久的免疫反应、不 能确定是否所有病毒均被灭活、裂解的DNA片段潜在致癌的可能性、生产费用高等缺点。

近年来，HSV减毒活疫苗的研制主要集中在特异性地造成HSV病毒基因缺失某一区 段，使HSV的神经毒性减弱，建立潜伏感染的能力降低，DNA复制障碍等，同时保持病毒的增 殖能力和免疫原性这一目标上。但有报道指减毒活疫苗隐患较多，一方面，重组的HSV病毒 经过反复的细胞培养后，仍然不能获得稳定的减毒株，减毒活疫苗可能重新获得病毒毒性； 另一方面，减毒的病毒可能会潜伏于病人体内，有可能会与感染的HSV野生病毒株重组，重 新获得病毒毒性。此外，某些HSV基因也存在致癌的潜在可能。新型DNA疫苗虽能同时诱导体 液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在 单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着重要的作用，由于上述现有 的几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床 上应用的单纯疱疹病毒疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶 段。基因缺陷减毒疫苗是一种利用基因技术方法制备得到的疫苗，结合了减毒活疫苗以及 灭活疫苗的优点。制备方法是将病毒复制必需的基因部分去除后，缺陷性病毒疫苗在经过 遗传改造过的细胞株里生长，以构成性地表达缺失基因的病毒产物。子代病毒缺乏必需基 因产物，因而没有传染性。研究表明，在动物实验中，这种疫苗具有抗HSV原发感染作用。

传统的细胞培养生产病毒疫苗，产量低，纯度不高。微载体为单层贴壁细胞的生长 繁殖提供了一个大的表面区域，为细胞生长提供了一个匀质的悬浮培养系统。反应器微载 体培养系统具有很大的优势：1）比表面积大，1g微载体提供的表面积约等于15个T75规格的 细胞培养瓶提供的表面积，较大的比表面积可有效的节省空间和培养基以及昂贵的添加剂 如血清、生长因子等的成本，提高了培养基的利用率和单位体积细胞的产率；2）有利于反应 器中高效的气液传递，有效的维持细胞生长的关键物理、化学和生物环境；3）反应器微载体 培养系统可用于调整和检测细胞培养所需的pH、pO₂、剪切力水平、搅拌和营养成分，因此可 实现更严格的调整细胞增殖、分化等不同的生物过程，批次间具有较高的重现性；4）微载体 密度和体积远大于细胞，产物与细胞可方便的分离，换液简单，除了作为锚地依赖型细胞增 殖的基质外，微载体也用来提供分化和未分化细胞的放大培养。贴壁细胞的微载体培养系 统被认为是今后对抗传染性疾病大流行的一种关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的 方法。本发明提供的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法可以大量制备 高质量的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗，可以实现工业大规模生产疱疹病毒疫 苗，同时，本发明制备的疫苗可以安全有效的激活人体的免疫应答，降低疱疹病毒对人体的 感染。