[发明专利]单纯性疱疹病毒I型UL18基因缺失减活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种单纯性疱疹病毒I型UL18基因缺失 减活疫苗的制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus，HSV），属于疱疹病毒科（Herpesviridae family），α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinaefamily）。HSV病毒为双链DNA病毒，从 外到内含有囊膜、皮层、衣壳及基因组等四种病毒结构。HSV-1是单纯疱疹病毒的一种，主 要引起喉、口、眼、脸及神经系统的感染，可引起疱疹性脑炎，唇疱疹等多种疾病。有调查结 果显示，90%以上的人一生中均会受到疱疹病毒的感染，单纯疱疹病毒感染已成为世界上第 四大的传染性疾病。

HSV病毒在细胞内的增殖是一个有序的复杂过程，按先后顺序HSV病毒的胞内增殖 过程大致可以分为以下几个阶段：1）病毒吸附于宿主细胞膜的表面；2）病毒穿过细胞膜；3） 病毒基因组进入细胞核内；4）病毒基因的表达；5）基因组DNA的复制；6）病毒核衣壳的组装； 7）病毒颗粒的形成；8）子代病毒的释放。HSV病毒在细胞内基因组DNA的复制是病毒产生致 病性的必须过程，若缺少该过程，将不能组装成完整的病毒颗粒，从而严重减低对机体的致 病性。

目前临床上治疗HSV病毒感染的主要药物是以阿昔洛韦（ACV）为代表的核苷类 似物，为临床治疗HSV感染的“金标准”。此类药物均通过影响病毒DNA的复制过程而发 挥抗病毒作用，为HSV病毒复制过程特异性的抑制药物。这类药物在在上世纪80年代开 始ACV耐药株就有出现，且在接受骨髓移植病人、免疫缺陷人群和艾滋病人群体中更易 出现耐药。目前临床应用最多的药物还是核苷类似物，由于此类药物的过多应用，耐药的问 题也越来越严重，尤其是在发生耐药后没有很好的替代药物的治疗，往往给患者带来极大 的痛苦。目前并无单纯疱疹病毒感染，尤其是复发性感染的特效治疗方法，抗病毒药物常规 用药虽能缓解一些临床症状，但不能彻底清除体内潜伏的病毒，也不能减少复发次数，因此 迫切需要开发能有效防治单纯疱疹病毒感染的疫苗。

病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养 筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。 中国专利申请201010253601.5公开了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方 法，该减毒活疫苗敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因。 该减毒活疫苗是敲除了其基因组中的复制或感染非必需基因片段，能够诱导机体的免疫应 答系统，及时清除感染的病毒，抑制感染的进一步发展，但其制备方法有诸多不足之处：（1） 选取拟敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源侧翼序列和荧光蛋白基因组成同源 重组框，由于目的片段太长使PCR扩增困难；（2）选择pShuttle-CMV载体，同源重组框整合到 拟敲除基因的正确位置效率偏低，成功机率不大；（3）用荧光蛋白基因代替拟敲除病毒基因 用于筛选鉴定，虽然此方法快速、简便，但最终未能将荧光蛋白基因去除，构建的减毒活疫 苗仍表达该蛋白。

因此，现有技术存在减毒活疫苗的制备方法复杂、成功效率偏低等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL18基因缺失 减活疫苗的制备方法，通过该方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生 毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。

本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL18基因缺失减活疫苗的制备方法，包括如下 步骤：

S1单纯疱疹病毒I型UL18基因的同源重组敲除，得到不含UL18基因和外源基因的重组 菌株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC-HSV-1载体和pREDI重组质粒的宿主 菌；

S2BAC载体的切除及HSV-1UL18基因缺失减活疫苗的获得。

优选地，所述步骤S1包括如下步骤：

S1.1pREDI重组质粒的构建：设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片 段；设计I-SceI的PCR扩增引物，PCR扩增得到I-SecI片段；将所述PrhaB片段和所述I-SecI 片段通过重组PCR连接，得到PrhaB-I-SecI片段；将所述PrhaB-I-SecI片段和pKD46λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒；