[发明专利]一种深海来源羧酸酯酶及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种深海来源羧酸酯酶DMWf18‑543及其编码基因与应用。一种深海来源羧酸酯酶DMWf18‑543编码基因由宏基因组筛选获得，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的羧酸酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，酶活达444U/mg。羧酸酯酶DMWf18‑543催化水解温度范围为15～55℃，优选为30～45℃；所述水解的pH值为5.0～10.0，优选为6.0～8.0。该酯酶可广泛应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海沉积物来源羧酸酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

脂类水解酶包括羧酸酯酶(EC3.1.1.1)和脂肪酶(EC3.1.1.3)，广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的水解和合成。羧酸酯酶主要催化少于10个碳的短链酰基甘油，脂肪酶主要催化大于10个碳的长链酰基甘油。脂类水解酶具有许多优良特性，如催化反应不需要辅助因子，手型选择特异性高，拥有较广的底物谱，以及在有机溶剂中保持高稳定性等。脂类水解酶是工业生产中重要的催化剂，可广泛应用于手性药物催化、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业以及食品加工等方面。

目前已经有许多微生物来源的脂肪酶得到了商业化生产，并应用于生产生活的各个方面。而羧酸酯酶作为一种重要的工业用酶，在实际生产中得到应用的种类和数量还十分有限。新型羧酸酯酶资源的挖掘和积累是满足食品和化工等工业对羧酸酯酶日益增长需求的必要条件。本发明运用宏基因组构建和羧酸酯酶活性筛选的技术，获得深海来源新型羧酸酯酶，并研究其酶学性质。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的深海来源羧酸酯酶、其编码基因及其制备方法，该羧酸酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中，以三丁酸甘油酯作为底物筛选羧酸酯酶活性，获得一种新的羧酸酯酶DMWf18-543，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

将该羧酸酯酶序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的也是宏基因组来源的酯酶，相似性为81％(其在GenBank数据库中的注册号为AFB82690)。系统发育分析结果表明，羧酸酯酶DMWf18-543属于脂类水解酶家族中的第IV家族。根据氨基酸序列推测，羧酸酯酶DMWf18-543的催化中心由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸(氨基酸位置为144、238和268)组成，其中丝氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸(氨基酸位置为142至146)组成的保守序列中，因此羧酸酯酶DMWf18-543属于第IV家族GDSAG亚家族。氧离子洞位于75和76位两个甘氨酸。综上所述，DMWf18-543应为脂类水解酶第IV家族中的一名新成员。

在不影响酯酶DMWf18-543蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置(优选142-146、238和268氨基酸位置)的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶DMWf18-543活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选远离142-146、238和268位氨基酸位置)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶DMWf18-543突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。