[发明专利]一种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂的细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂用细胞系及其构建方法，属于医药技术领域。

背景技术

流感病毒是一种负链RNA病毒，能造成人类急性上呼吸道感染并能致死。季节性流感影响世界5％-15％的人口，每年造成大约50万人死亡。流感病毒按照抗原类不同可分为A、B、C三种血清学上差异明显的亚型，其中对人类危害最大的是甲型(A型)流感病毒，例如高致病性禽流感H5N1和H7N9，及2009年出现的H1N1的流行造成大量人员死亡[1,2]。

目前治疗流感的主要方式是疫苗和针对膜蛋白HA和M2的小分子药物。因为流感病毒变异非常快，导致无法准确预测将要流行的病毒，因此疫苗有时会错配，导致保护效果降低[3]。

目前治疗流感的药物按作用机制分为两类：M2离子通道蛋白抑制剂，如金刚烷胺；和NA抑制剂，如奥司他韦、帕拉米韦、扎那米韦。M2离子通道蛋白抑制剂存在神经毒性，长期服用易产生耐药毒株和对B型流感无效等缺陷；而NA抑制剂同样也存在耐药性问题，因此寻找新型的抗流感病毒药物和途径势在必行[4]。

甲型流感病毒的基因组是由8条负链RNA组成，每条病毒RNA都与核蛋白、RNA聚合酶亚单位(PB2、PB1、PA)组合形成聚合酶 复合物。其中RNA聚合酶亚单位(PB2、PB1、PA)是负责流感病毒复制和转录的重要复合物。该三聚体复合物的有效组装是流感病毒RNA复制的限速步骤，对于流感病毒RNA的合成来说至关重要。在进化上，流感病毒聚合酶结构和功能都非常的保守，针对流感病毒聚合酶的药物相对于针对表面蛋白的药物来讲具有更好的广谱性和耐药性[5,6]。现在已发现有多种能抑制流感病毒聚合酶组装的多肽或小分子抑制剂，譬如PB1_1-25,PB1_731-757等，能分别破坏PA-PB1，PB1-PB2的相互作用，小分子361能破坏PA-PB1的相互作用[7-9]。但研究这些抑制剂的方法都是采用类似CoIP，BiFC或GST pull down等方法，比较费时费力。

另外，天然存在的小分子种类和数量巨大，要想从这些小分子中筛选能有效抑制流感病毒聚合酶组装的抑制剂，使用一个高效的筛选方法就很有必要。目前对流感病毒聚合酶研究主要应用的是流感病毒聚合酶的微型复制系统—表达PB2、PB1、PA、NP和RNA报告基因的细胞。为了更高效的检测流感病毒的感染或筛选抑制流感病毒复制的抑制剂等，人们将该RNA报告基因转到细胞中形成稳定表达细胞系。然而，目前还没有用于筛选针对流感病毒聚合酶组装的小分子抑制剂的细胞系。

综上所述，能用来筛选针对流感病毒聚合酶组装的抑制剂的细胞系具有广阔的应用前景。

以上背景技术中提及的文献具体分别参考于以下：

1. Stamboulian,D.,Bonvehi,P.E.,Nacinovich,F.M.&Cox,N.(2000)Influenza,Infect Dis Clin North Am.14,141-66.

2. Neumann,G.,Chen,H.,Gao,G.F.,Shu,Y.&Kawaoka,Y. (2010)H5N1influenza viruses:outbreaks and biological properties，CellRes.20,51-61.

3. de Jong,J.C.,Beyer,W.E.,Palache,A.M.,Rimmelzwaan,G.F.&Osterhaus，A.D.(2000)Mismatch between the 1997/1998influenza vaccine and the major epidemic A(H3N2)virus strain as the cause of an inadequate vaccine-induced antibody response to this strain in the elderly,J Med Virol.61,94-9.

4. Boltz,D.A.,Aldridge,J.R.,Jr.,Webster,R.G.&Govorkova,E.A.(2010)Drugs in development for influenza,Drugs.70,1349-62.