[发明专利]一种DPYD*9A基因多态性的引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD*9A基因多态性的引物及其检测方法。

背景技术

二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)编码基因是位于1号人类染色体的短臂上(1q22)，基因全长约150kb，含有3kb的编码序列，其由23个外显子构成，长度从69bp到1404bp，基因中内含子由长短不等的序列组成。二氢嘧啶脱氢酶是作用于5-FU药物代谢途径的关键酶之一，是分解代谢的限速酶，其含量的高低决定了5-FU药物的代谢速度，进而影响体内药物的毒性和疗效。

5-Fu及其前体药物卡培他滨广泛用于肿瘤化疗，80%以上的5-Fu及其前体药物是通过DPD代谢降解为无活性代谢物二氢氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同个体间DPD酶活性存在明显差别，导致药物清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应存在明显的个体差异性。

DPYD突变会影响DPD酶活性的改变，中国北方人群的研究发现DPYD*9(外显子2，T85C)的突变频率较高(11.25%)。因此，检测DPYD基因多态性可以对肿瘤患者进行药物敏感指导，提高治疗效果，降低药物的毒副作用。

中国专利CN102146440B公开了一种甄别DPYD基因*9A突变位点的PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物、EvaGreen荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶。该实时荧光PCR检测方法可以实现二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点快速、准确、特异分析。但是，但其高居不下的假阳性率为实际应用所诟病，而且该检测方法还存在检测通量少，每次只能检测一种突变类型的缺陷，不能满足实际应用的需要。

中国专利CN102952866B公开了一种DPYD基因多态性检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片包括野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成。该液相芯片可用于并行或单项检测DPYD基因三种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型。但是，上述检测方法操作复杂，不利于大规模的推广和应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种DPYD*9A基因多态性的引物及其检测方法，该引物主要用于检测DPYD基因的DPYD*9A(c.85T>C)位点，具有特异性强、检测灵敏度高、准确性好等优点，为DPYD*9A基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。

本发明提供了一种DPYD*9A基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物为：针对DPYD*9A的上游引物5’-CTGTCTTTAGAGTATCCTGGCTTT-3’（SEQIDNO.1）和下游引物5’-CTTACAATGTGTGGAGTGAGGTA-3’（SEQIDNO.2）；所述SNaPshotPCR引物为：针对DPYD*9A的SNaPshotPCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTAACACAAACTCATGCAACTCTG-3’（SEQIDNO.3）。

另外，本发明还提供了一种DPYD*9A基因多态性的检测方法，包括如下步骤：

S1提取DNA样品；

S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；

S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化；

S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。

进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。

进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：58℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。

进一步地，所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃10s；阶段2：55℃5s；阶段3：60℃30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃保温。

进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。