[发明专利]RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用

说明书

本发明属于生物育种领域，具体涉及一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用，该表达载体由以下步骤制成：（1）RT‑PCR扩增获得目的基因片段；（2）表达载体的构建。该表达载体在苹果抗病育种中的应用方法包括以下步骤：（1）将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转入根癌农杆菌；（2）苹果叶盘受体材料的无菌培养；（3）用农杆菌介导法转化苹果获得转基因材料；（4）转基因植株的检测；（5）对所得转基因阳性植株进行离体扩繁，移栽，即得。本发明将含有苹果茎痘病毒外壳蛋白（CP）基因保守片段的RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体遗传转化苹果，获得的转基因植株可以获得抗病毒的特性，在果树生产中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物育种领域，具体涉及一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用。

背景技术

苹果是我国果树的主栽树种之一，栽培面积和产量均居于世界之首。但是，近年来随着果树产业的迅速发展和苗木调运的日益频繁，病毒病的传播日益严重。苹果茎痘病毒（ASPV）是生产中主要的潜隐性病毒之一，植株受到其侵染后树势衰弱，引起产量和果实品质的下降，部分植株表现为叶片反卷、木质部茎痘斑、果实凹陷等，给果树生产造成严重的经济损失，目前尚无有效的化学防治方法。

近年来，苹果生产上通常采用的仍是传统的茎尖脱毒技术，通常包括营养系的初选、试管苗茎尖培养、热处理脱毒、病毒检测、无毒苗快繁等几个步骤。由于自然条件下病毒的遗传物质RNA极易发生变异，这就使得已有脱毒苗木在栽培过程中难免还会受到病毒的再次侵染，难以做到有效脱毒。

目前，通过基因工程培育抗病毒品种，已成为获得抗病毒植物最为有效的技术途径，但目前果树植物上通常采用的仍是直接利用病毒外壳蛋白基因进行转化的传统策略，主要包括以下几个步骤：（1）RT-PCR扩增获得病毒基因的完整序列；（2）将目的基因插入表达载体，构建含有目的基因的过表达载体；（3）将过表达载体转入根癌农杆菌中；（4）用农杆菌介导法转化植物获得转基因植株。该传统策略操作繁琐，要求苛刻，安全性尚得不到保证。

RNA干扰（RNAi）是近年来发展起来的一种dsRNA介导的高频、高效、高度特异的基因沉默技术，可通过将外源dsRNA导入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解，抑制靶基因的表达，是发生在转录后的基因沉默现象。RNAi介导的植物抗病毒基因工程的原理是，利用RNAi合成与病毒同源的dsRNA，并将其转入植物细胞内，由植物体的RNAi机制对入侵病毒的RNA进行特异性切割降解，从而保护植物体不受病毒危害。虽然，通过RNA干扰技术沉默病毒外壳蛋白(CP)基因在某些作物(如大豆、烟草等)上已经获得了良好的抗病毒效果，由于苹果为多年生木本植物，与草本植物相比，利用基因工程进行抗病育种技术的发展水平明显滞后，因此在苹果上应用障碍较大，长期得不到实施。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用，获得的转基因植株具有抗病毒特性，在果树生产中具有良好的应用前景。

为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种抗苹果茎痘病毒植株的育种方法，包括以下步骤：

（1）RT-PCR扩增获得目的基因片段：

根据病毒基因全长序列，在保守区段设计合成引物；提取感病材料的植物总RNA，通过反转录获得cDNA第一链，并以此为模板、利用所合成引物进行PCR扩增，获得目的基因片段；将目的基因片段切胶回收，连接至T载体，测序验证；

优选采用以下步骤：

（1.1）根据Genebank公布的ASPV病毒外壳蛋白基因全长序列，在保守区段设计、合成引物，

ASPV-F：5'-CACCAGTTGCATTGATTGGGAT-3，