[发明专利]一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法。

背景技术

四环素类抗生素包括金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。本品为广谱抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体也对本品敏感。

国内外的大量研究表明，由于四环素药物长期和大量使用，副溶血弧菌对四环素类药物的耐药性十分严重。常见的四环素耐药基因已经发现的有：TetA,TetB,TetC,TetD,TetE,TetG等。四环素耐药性菌株通过水产产品以及食物链等途径引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。

目前我国水产产品致病菌耐药性检测控制中，在四环素药耐药性检测研究方面，对病原菌耐药性基因的研究内容较少。传统方法是通过测定副溶血弧菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的副溶血弧菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，包括如下步骤：

（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；

（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05~0.08U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01~0.02%甘油和0.05~0.08%硫酸铵，30~40mMMgCl₂；

（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1）为：收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为0.35mmol/L的TetA-F、终浓度为0.35mmol/L的TetA-R、终浓度为0.35mmol/L的TetB-F、终浓度为0.35mmol/L的TetB-R、终浓度为0.55mmol/L的TetD-F、终浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸铵，35mMMgCl₂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应条件如下：90~95℃预变性8~12min，然后进入如下循环：94~95℃变性50~60s、54~55℃退火1~1.2min、72~74℃延伸45~50s，共30~35个循环，循环结束后于72℃延伸8~10min，2~4℃保存。