[发明专利]一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法

说明书

本发明涉及一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，利用发酵后的主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松及底物RSA与浓硫酸反应显示不同颜色，根据朗伯比尔定律结合三维数据建模，通过可见光双波长检测，即可间接计算发酵液中氢化可的松的转化率。本发明操作简单快捷，测试时间短、试样用量小，容易实现并行操作，精确性高。重复性误差在10％以内；可检出氢化可的松的转化率在10％‑95％之间，检测方法操作简单快捷，单个样品的测试时间在20min之内，而薄层层析法及高效液相色谱法所需时间较长。

技术领域

本发明属于生物转化制药中药物产量的检验分析领域，涉及一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，适用于药物的生物转化工艺过程研究和检测。

背景技术

氢化可的松是一种肾上腺皮质激素类药物,在临床上应用广泛。同时它还是生产泼尼松等其他类高效皮质激素药物的基础原料。

HC的生产是以化合物RS(17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮)或化合物RSA(17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)为底物经过微生物的11β-羟基化反应得到。微生物菌种对HC的转化率和收率影响很大，因此选育高产氢化可的松的优良菌种一直是工业上的研究目标。

工业上选育高产氢化可的松的优良菌种，一般是采用诱变育种方式。诱变育种过程中，经诱变产生高产菌株的频率很低，因此都需要从庞大的菌种库中检出目标菌种。氢化可的松转化率的检测，一般是首先用有机溶剂将摇瓶发酵的发酵液成分萃取出来，再通过薄层层析法，对HC的产量作定性检测。最终通过高效液相色谱法，确定菌种对氢化可的松的转化率。

薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数工厂检测都在使用的方法。薄膜层析法，存在取样量大，萃取剂易挥发，操作繁琐，定量不准确，易受环境干扰等问题；另有液相色谱法测定结果准确，但检验时间过长，程序复杂，仪器价格昂贵，均不适于生产现场快速检验的要求。因此，这些点已远远不能满足现代检测，以及高通量筛选高转化率菌种的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种精度和灵敏度都高的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法。

本发明实现目的的技术方案是：

一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，步骤如下：

⑴利用主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松、底物17-羟基孕甾-4-烯-3, 20-二酮-21-醋酸酯遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙酯将发酵液中成分萃取出来，加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化；

⑵先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/ 浓硫酸、RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm；

⑶根据朗伯比尔定律结合三维数据建模二阶校正得出氢化可的松转化率的计算公式；

⑷通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的OD值，即可计算出待测发酵液中氢化可的松的转化率。

而且，具体步骤如下：

⑴待测菌种发酵产生的发酵液降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25％的RSA，继续培养至72h；

⑵将步骤⑴得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯，充分萃取后取6μL上层有机相置于96孔石英酶标板中；

⑶待步骤⑵中96孔石英酶标板中的乙酸乙酯挥发后，加入200μL浓硫酸，反应15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的OD值；

⑷将氢化可的松、表氢化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液；