[发明专利]孔鳐软骨蛋白抗氧化肽及其用途

说明书

本发明公开了一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽及其用途，本发明以孔鳐软骨为原料，通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Gly‑Glu‑Glu‑Gly‑Pro‑Arg‑Gly(GEEGPRG)，ESI‑MS测定分子量为700.71 Da；制备的高活性抗氧化肽具有较强的自由基清除活性和良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等进行开发。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽及其用途。

背景技术

孔鳐（Raja porosa）别名喀氏鳐，俗称劳板鱼、劳子、甫鱼、铧子鱼、锅盖鱼、虎色、夫鱼、鲂鱼，属于软骨鱼纲 Chondrichthyes、鳐形目 Rajiformes、鳐科 Rajidae、鳐属Raja的鱼类。分布于北太平洋西部，中国的东海、南海及黄海、渤海均产之。

孔鳐亦为我国常见海洋药物，全身多部位可以入药，例如其肝味甘，性平。归胃、肺经。具有滋补强壮，明目，止痛，健骨等功效。对治疗夜盲症，软骨症，干燥性眼炎，营养不良，佝偻病，久病体虚，肺结核等疾病均有疗效，还用于孕妇及幼儿的滋补剂。并且具有散瘀止痛，祛风除湿，生肌敛疮，解毒消肿之功效。主治风湿性关节炎，疮疖，跌打肿痛，溃疡等症。现代研究证明，孔鳐软骨多糖和蛋白具有显著的生物活性，能够很好的抑制肿瘤新生血管的生成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的孔鳐软骨蛋白抗氧化肽。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽：该孔鳐软骨蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为七肽化合物，氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)，ESI-MS测定分子量为700.71 Da。

该孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法为：

1）孔鳐软骨总蛋白粗提物的制备：称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的孔鳐软骨浸于4～6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中（含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7～8），于4 ℃下搅拌抽提36～48 h。提取液在4 ℃下以4000～6000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4 ℃下透析24～48 h，透析袋内溶液即为孔鳐软骨总蛋白粗提物。

2）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取孔鳐软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 ℃下静置4～6 h后，于4 ℃、10000～12000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得孔鳐软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白。

3）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取孔鳐软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5 mL溶于Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH 7.5～8.5），按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入胰蛋白酶（1.9×10⁴ U/g），于40 ℃酶解3～5 h，然后于90 ℃、10min灭酶活，酶解液于4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液。

4）孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得抗氧化肽。