[发明专利]灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）灰星鲨软骨总蛋白粗提物的制备：称取灰星鲨软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的灰星鲨软骨浸于4～6倍体积的1.0mol/L盐酸胍溶液中，于4℃下搅拌抽提36～48h；提取液在4℃下以4000～6000r/min离心15～25min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4℃、10000～12000r/min离心15～25min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质；将滤液装入分子截留量为8000的透析袋中，用pH值为7.6的Tris-HCl缓冲液于4℃下透析24～48h，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨总蛋白粗提物；

2）灰星鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取灰星鲨软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20℃下静置4～6h后，于4℃、10000～12000r/min高速离心20min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得灰星鲨软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白；

3）灰星鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取灰星鲨软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5mL溶于0.05mol/L pH7.5～8.5的Tris-HCl缓冲液，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入1.9×10⁴U/g的胰蛋白酶，于40℃酶解3～5h，然后于90℃、10min灭酶活，酶解液于4℃、10000～12000r/min离心15～25min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液；

4）灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到抗氧化肽；

其中，所述步骤1）中的盐酸胍溶液含0.02mol/L MES和0.02mol/L EDTA，pH值为7～8；

所述步骤4）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：离子交换树脂层析：将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物； 凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱纯化进行纯化，根据对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性进行筛选，得1个高活性抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met，ESI-MS测定分子量为905.00Da。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反相高效液相色谱条件为：进样量10～15μL；色谱柱是规格为250mm×4.6mm，5μm的ZorbaxSB-C18；流动相为水-乙腈梯度洗脱，0～32min乙腈浓度由0匀速升至50%；洗脱速度0.6~1.0mL/min；紫外检测波长280nm。