[发明专利]一种免疫细胞瘤苗的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种免疫细胞瘤苗的制备方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是一类最为严重危害人类健康的疾病,每年全国大约三百万人诊断为新发肿瘤患者，二百多万人死于癌症。尽管可以通过手术、放疗、化疗进行治疗,但大多数病人仍死于肿瘤的复发和转移。所以,如何清除残留的微小肿瘤组织或肿瘤细胞则是现代肿瘤免疫学有待解决的问题之一。由于癌症发生的根本原因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的生长，所以提高免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞将从可以根本上去除肿瘤。随着新技术在临床上的应用推广，免疫疗法逐渐成为治疗癌症最有效的方法之一。

树突细胞或抗原递呈细胞（DC）是目前所知的唯一能激活初始性T细胞且功能最强的专职抗原提呈细胞(AntigenPresentingCells，APC)。DC不但可以激活自然杀伤性细胞(NK)及杀伤性T细胞(CTL)，同时，还能激活B细胞，在诱导细胞免疫及体液免疫中起着重要作用。

DC瘤苗就是通过体外模拟体内的环境，诱导单核细胞分化为成熟DC细胞，同时，使DC细胞负载相应的抗原信息，包括肿瘤特异性相关抗原、免疫抑制性抗原等来激发机体体内特异性的肿瘤免疫应答，进以清除肿瘤细胞。这种携带肿瘤相关抗原信息的功能性的DC被称为DC瘤苗。

2010年4月，美国FDA批准自体树突状细胞疫苗(sipuleucel-T，Provenge)治疗内分泌治疗失败的无症状转移性前列腺癌。其原理是体外激活DC细胞的同时，承载单一肿瘤抗原PAP于DC表面，然后回输患者体内，进一步引起抗肿瘤的免疫反应。研究表明，与安慰剂组相比，该疫苗治疗组中位生存期延长4.1个月，一年的死亡风险降低22%。

但在T细胞表面存在免疫抑制因素-免疫检查点（immunecheckpoint）-的存在，这些免疫检查点能抑制T细胞的激活，增殖和效应功能。而这些免疫检查点控制共刺激和抑制信号的平衡，而共刺激和抑制信号在维持自身耐受，组织器官的自我保护和调节性T细胞应答的幅值与持续时间方面具有重要作用。两个主要的免疫检查点分子――细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA4)和程序性细胞死亡的蛋白1(PD1)，是在细胞毒性T细胞上表达的负调节因子。T细胞表面上的免疫检查点CTLA-4和DC细胞表面的B7类分子结合，会阻止T细胞表面上的激活分子CD28与DC细胞表面的B7类分子结合，进一步抑制DC细胞抗原递承的功能和T细胞活化激活的能力。所以，在免疫细胞激活的过程中，利用CTLA-4抗体阻碍CTLA-4与B7类分子的结合，可以增强DC的抗原提呈作用，提高抗原特异性的T细胞比例。

由于缺乏对免疫抑制靶点的控制，当前临床上用的DC瘤苗治疗癌症普遍存在着专一性低，回输后效用小的弱点。为克服DC疫苗的上述缺点，本专利的创新点在于：在DC制备过程中加入CTLA-4抗体来增加DC的活性，进而增加抗原专一性的T细胞比例，在回输之后增加免疫系统杀伤肿瘤细胞的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫细胞瘤苗的制备方法及其应用，以解决上述技术问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种免疫细胞瘤苗的制备方法，包括如下步骤：

1）在初始培养PBMC的培养基中，加入DC细胞活化因子，并加入一种或几种肿瘤抗原蛋白或长链多肽，置于37℃、5%CO₂孵箱中培养12-16小时，在此过程中，肿瘤抗原被单核细胞摄取，分解和递呈至单核细胞表面；

2）在继续上述培养PBMC的基础上，加入促进单核细胞成为DC细胞活化成熟的细胞因子和一种或几种类铎受体激活因子，和能与DC表面上MHCI结合的一种或几种多肽，与此同时加入抗人CTLA-4抗体共同培养，阻断CTLA-4的抑制作用，置于37℃、5%CO₂孵箱中培养12天，即成。

所述的DC细胞活化因子为GM-CSF、IL-4。

所述的类铎受体激活因子为CpG、poly（I：C）、IFN-γ、R848。

一种免疫细胞瘤苗在癌症治疗和其他临床的应用。该免疫细胞瘤苗增加了抗原特异性T细胞比例，对肿瘤细胞抗原具有较高的专一性。