[发明专利]检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全快速检测领域，具体为一种检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物的ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

呋喃唑酮（Furazolidone，，曾用名称：痢特灵）是一种硝基呋喃类抗生素，可用于治疗细菌和原虫引起的痢疾、肠炎、胃溃疡等胃肠道疾患。呋喃唑酮为广谱抗菌药，对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制作用，包括沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、金葡菌、粪肠球菌、化脓性链球菌、霍乱弧菌、弯曲菌属、拟杆菌属等，在一定浓度下对毛滴虫、贾第鞭毛虫也有活性，其作用机制为干扰细菌氧化还原酶从而阻断细菌的正常代谢，因其良好的抗菌作用和药动力学的特性，曾被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以是实验动物发生癌变和基因突变，其在动物源性食品中的残留，可以通过食物链传递给人类，长期摄入会引起各种疾病，根据联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会的报告，呋喃唑酮及其代谢产物有致癌性，且易产生抗药菌株，容易引起畸胎。中华人民共和国农业部将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检出。FDA于2002年禁止了硝基呋喃类（包括呋喃唑酮）在动物性食品中的使用。

呋喃唑酮进入动物体内很快会代谢，成为呋喃唑酮代谢物，且呋喃唑酮代谢物对人体有着与呋喃唑酮同样的危害，而在组织中结合的呋喃代谢产物则能存留较长一段时间，所以在实际检测中，监督管理部门以检测代谢产物为目标实现检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃唑酮代谢产物为AOZ。

目前，检测呋喃唑酮代谢物的最常用方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，仪器方法准确度高、特异性好，但是仪器昂贵、依赖于专业检测技术人员，难以满足快检要求，酶联免疫方法结合了色谱技术，操作简单、检测时间短，适用于大量样本筛查，检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物残留量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测呋喃唑酮代谢物残留的酶联免疫试剂盒，该检测试剂盒操作简便、检测时间短、反应灵敏度高。

本发明所提供的试剂盒包括包被有偶联抗原的酶标板、呋喃唑酮代谢物标准品、呋喃唑酮代谢物高浓度标准品、酶标二抗、抗体浓缩液、底物液A液、底物液B液、终止液和浓缩复溶液、浓缩洗涤液、2-硝基苯甲醛。

所述呋喃唑酮代谢物抗体是由呋喃唑酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，免疫小鼠得到，所述呋喃唑酮代谢物半抗原由呋喃唑酮溶于硫酸溶液中，降温至0-4℃，缓慢加入10%亚硝酸钠溶液（降温至0-4℃），制备得到。向溶液中加入溶解好的蛋白即可进行蛋白偶联。

半抗原直接与载体蛋白进行偶联，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

1）将呋喃唑酮代谢物与琥珀酸酐反应，制备呋喃唑酮代谢物半抗原；

2）将呋喃唑酮代谢物半抗原与载体蛋白偶联，制备呋喃唑酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物；

3）将呋喃唑酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物包被在酶标板孔上；

4）试剂盒组装；

5）利用试剂盒检测样品中呋喃唑酮代谢物的残留；

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试剂盒检测动物源食品中呋喃唑酮代谢物残留的方法，它包括步骤：

（1）样品处理；

（2）用试剂盒进行检测；

（3）检测结果分析。

本发明的试剂盒原理：采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的AOZ经衍生化后和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物呋喃唑酮代谢物的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中呋喃唑酮代谢物的残留量。

本发明的试剂盒采用高特异性的呋喃唑酮代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，保证了检测结果的可靠性；在检测过程中，能够使微孔上的偶联抗原与待检样品液充分接触，充分反映，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、使用广泛、储存简单、保质期长的优点。其中，用本发明试剂盒检测样品中呋喃唑酮代谢物残留的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1呋喃唑酮代谢物半抗原合成路线。

图2呋喃唑酮代谢物半抗原鉴定图。