[发明专利]一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测领域，特别涉及一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的 试剂盒及检测方法。

背景技术

蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生 变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，最常见的是半胱氨酸，蛋白质对空气中 的氧较为敏感，容易发生结构的转变，形成一系列聚合物。

钙调蛋白磷酸酶B亚基(CNB)是钙调蛋白磷酸酶Calcineurin，(CN)的调节亚基。CN 是目前所知唯一一种依赖Ca²⁺/CaM的蛋白磷酸酶，它具有比较窄的底物专一性。于上世纪70 年代末、80年代初由加籍华人王学荆、美籍华人张槐耀及美国的ClaudeB.Klee分别发现并 从牛脑中提纯。该酶由A、B二亚基以1:1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，相对分子质量 61×10³；B亚基(CNB)是调节亚基，相对分子质量19×10³。

RhCNB具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，单体是一种含有两个巯基结构的蛋白，在 生产、放置等过程中，易受温度、水分、pH值、光照、氧化等因素影响形成二聚体、三聚体等多 聚体结构，造成各组分比例不稳定，无法准确测定其量。其纯化工艺中又需要用到缓冲盐、 络合剂、金属离子、氧化还原性物质等等对蛋白测定有干扰的物质。

目前采用细胞培养的体外抑瘤试验等方法往往无法取得理想的线性范围，结果重 现性差，无法完成方法学验证。因此，提供一种rhCNB的生物学活性的测定用组合试剂、试剂 盒及测定方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的试剂盒及检测 方法。本方法具有较强的专属性，经试验证明，本法检测结果重复性好，能实现对rhCNB产品 的有效质量控制。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了rhCNA或其突变体或剪切体在制备检测rhCNB活性的试剂中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述应用中所述的rhCNA或其突变体或剪切体 为rhCNA或其突变体rhCNAΔ316、rhCNAΔY311、rhCNAΔD313、rhCNAΔV314、rhCNAΔY311， 或其剪切体rhCNA420(1-420)、rhCNA388(1-388)、rhCNA347(1-347)。

本发明还提供了一种组合试剂，包括rhCNA或其突变体或剪切体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述的rhCNA或其突变体或剪 切体为rhCNA或其突变体rhCNAΔ316、rhCNAΔY311、rhCNAΔD313、rhCNAΔV314、rhCNAΔ Y31，或其剪切体rhCNA420(1-420)、rhCNA388(1-388)、rhCNA347(1-347)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂中还包括反应底物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述反应底物为pNPP。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂还包括还原剂、rhCNB对照品、缓 冲液、BSA、MnCl₂或CaCl₂中的一种或两者以上的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂包括底物溶液、还原剂、rhCNA或 其突变体或剪切体、rhCNB对照品。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述反应底物包括pNPP： 0.005～0.08mol/L、BSA:0.2mg/ml、Tris-HCl(pH7.4):0.05mol/L、MnCl₂:0.001mol/L和 CaCl₂:0.001mol/L。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述还原剂可以为DTT，所述 DTT溶液的浓度为1mol/L。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述rhCNA或其突变体或剪 切体为已测定比活性的rhCNA或其突变体或剪切体。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述rhCNB对照品为已测定 比活性的rhCNB对照品。