[发明专利]一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途

说明书

本发明公开了一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途，所述转座子包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；一种人工设计合成的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；一种基因载体，所述的基因载体包含所述的建鲤反转录转座子和/或所述人工设计合成的核苷酸序列SEQ ID NO.2。所述的建鲤反转录转座子和基因载体在介导DNA导入细胞中的应用。本发明通过在建鲤肝细胞中进行转座活性验证，证实上述转座子具备转座活性，所述的基因转移系统能在建鲤肝细胞中进行高效转座，因而本发明为进一步验证转座子的转座效率以及采用该转座子在脊椎动物中进行相关研究及应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种建鲤ty3-gypsy反转录转座子JRE及其用途。

背景技术

DNA转座子 (transposon ) 是一类能在真核生物染色体上不断移动位置的功能性DNA片段, 对发现新基因和分析基因功能具有重要的作用, 被认为是导致真核生物遗传变异的主要原因之一。转座子作为插入突变原或分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆, 一些甚至可作为转化载体用于转基因动植物的制备。piggyBac转座子在果蝇(Bactrocera tryoni,)^[4]、家蚕( Bombyx mori)等昆虫中, 能作为一个高效、稳健的载体进行转基因研究, 并促进生殖种系转化。家禽上也有报道利用mariner转座元件可实现转基因鸡的制备。而在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中发现的Tc3转座元件则已经成功转化斑马鱼(Danio rerio)。根据转座方式的不同, 转座子可分为DNA转座子和反转录转座子(retrotransposon)。其中, 反转录转座子是指以RNA为中介, 反转录成DNA后进行转座的可动元件, 亦被称为返座元(retroposon)。近几年的研究表明返座元是真核生物中最重要的一类转座元元件, 也是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。按照序列结构中是否含有长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)又可分为LTR反转录转座子和无LTR反转录转座子。

LTR反转录转座子主要由2个开放阅读框(open reading frames, ORFs)构成, 即核心蛋白基因(gag)和酶基因区域(pol)。gag蛋白编码类似于RNA病毒颗粒反转录相关的蛋白, pol基因编码逆转录过程中的主要蛋白, 包括蛋白酶(PR)、反转录酶(RT)、RNase H和整合酶(INT)。RT和RNase H是反转子复制、转座的关键酶, INT主要作用是使反转录转座子插入到染色体中的新位点。由于pol基因同源性及INT蛋白的排列位置, LTR反转录转座子又分为ty3-gypsy和ty1-copia两大类。LTR逆转录转座子采用的是“拷贝–复制”的机制, 在宿主基因中不断扩增; 由于返座元带有增强子、启动子等调控元件, 最终会参与到宿主基因的表达及新基因的产生等过程。目前在多种水生生物基因组中已经鉴定出一些LTR反转录转座子, 如斑马鱼、金鱼（Carassius auratus）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）等, 但在建鲤中并没有LTR转座子的报道。反转录转座子的这种插入导致产生变导的功能在鱼类重要性状相关基因的筛选、重要基因的功能研究以及转基因动物等方面有着重要的研究和运用前景。例如, Tol2 转座系统已经用于多种动物的转基因研究, 成功获得突变体, 如果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、鸡(Gallusgallus)、小鼠(Mus musculus)等模式生物。