[发明专利]一种采用机械分离法提取骨组织中的成骨细胞的方法

说明书

本发明属于细胞提取分离鉴定领域，具体涉及一种采用机械分离法提取骨组织中的成骨细胞的方法。该方法省略了机械分离法中较难操作的刮骨步骤而采用了涡旋的方法，操作简单，涡旋条件相对固定，得到的碎骨程度相对稳定，可以反复操作，提取结果受操作手法等影响小。与常用的酶消化法或组织块贴壁法提取成骨细胞相比，意外地采用提取破骨细胞的方法提取出了成骨细胞，不仅提取方法简单、重复性好，而且提取出的成骨细胞成活率高、贴壁时间短。

技术领域

本发明属于细胞提取分离鉴定领域，具体涉及一种采用机械分离法提取骨组织中的成骨细胞的方法。

背景技术

成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和骨损伤修复起关键作用。由于许多因素的影响，骨组织结构、功能及骨代谢等方面的研究直接通过人体来进行受到限制，因此体外培养成骨细胞，作为常用的体外实验模型，成为研究骨生理、病理及修复组织工程的基础。为临床骨相关疾病治疗、骨生物学特性研究提供稳定高效的成骨细胞体外分离方法。

随着细胞培养技术的发展，目前已可从许多动物的骨、骨膜、骨髓基质及骨外组织中成功培养出典型的成骨细胞，目前成骨细胞的原代培养方法主要有酶消化法和组织块贴壁法，但上述方法均存在一定的局限性。酶消化法可使细胞很快的生长为单层，并在短时间内获得大量的细胞，Wong等(Target cells in bone for parathormone and calcitoninare different:enrichment for each cell type by sequential digestion of mousecalvaria and selective adhesion to polymeric surfaces[J].Proc Natl Acad SciUSA,1975,72:3167-71.)采用多次酶消化法于体外成功培养出成骨细胞，但是该法实验操作流程比较复杂，操作过程中容易污染，且消化条件控制不当易导致细胞损伤，延长细胞贴壁时间。组织块贴壁法利用细胞迁出，可最大限度保留组织中对细胞增殖具有促进作用的生长因子，贴壁时间较短，操作相对简单细胞不易污染，Robey等(Human bone cells invitro[J].Calcif Tissue Int,1985,37:453-60.)采用骨组织块培养法，但得到细胞数较少。此外，有人采用将酶消化法及组织块培养法相结合进行成骨细胞培养，黄洁等(大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究，南京铁道医学院学报，2000，19(2)，88-90.)，但酶消化法和组织块贴壁法获得的细胞纯度不高，得到的骨骼标本除了会带有其他的组织碎屑外，都易引入成熟的骨细胞等，难以计数细胞。

现有技术中提取分离成骨细胞的方法中，均存在操作复杂、条件不易控制的缺陷，导致成骨细胞提取分离过程后存活率低、且培养时间长的问题，严重影响了成骨细胞在骨组织研究领域中的应用。

因此，研究一种提取方法简单、快速、提取出的细胞成活率高和纯度高的成骨细胞提取分离方法具有重要意义。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中的成骨细胞培养方法复杂、操作条件不易控制导致的成骨细胞成活率低的技术缺陷，从而提出一种提取方法简单、快速、提取后成活率高和纯度高的成骨细胞提取分离方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种采用机械分离法提取骨组织中的成骨细胞的方法，包括以下步骤：

1)取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后消毒，取出放入培养皿中；

2)用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取股骨、胫骨、肱骨的长骨，放入盛PBS缓冲液的培养皿中，除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨，得到长骨干部分，置于盛有少量培养液的培养皿中，用手术剪将骨剪碎；

3)将剪碎的骨头及培养液转移至离心管，涡旋震荡使骨碎裂，静置待碎骨片沉降，收集细胞悬液；