[发明专利]一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建与应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

白酒是中国特有的蒸馏酒，独特风味，备受喜爱。高级醇和酯类是白酒中非常重要的成分，和其它风味物质以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约，发挥各自的特点形成不同香型和不同风格的白酒。酯类物质种类较多，在白酒中大多以乙酯形式存在，具有水果样芳香和口味，是酒芳香的主要担体，使人产生喜悦感。白酒中大部分酯对酒的风味都有积极作用，提高酒中酯类物质的含量可以增进酒的风味，改善酒的品质。高级醇味道大多似酒精，持续的时间长，有后劲，含量的多少和各种醇之间的比例对白酒的风味有着重要的影响。适量的高级醇和协调的组分比可以赋予白酒特殊的香味，衬托出酯的香气，使酒的口感协调、柔和。倘若高级醇含量不足，酒味将变得稀薄单调，口感不饱满；反之，高级醇含量过高会使酒产生异杂味，影响酒的风味和品质。另外，高级醇在人体内的氧化速度比乙醇慢，停留时间较乙醇长，其对人体的毒害作用远远高于乙醇。因此，白酒中高级醇的含量必须控制在合适的范围内。

如何提高白酒中酯的含量和降低高级醇的含量，一直都是我国普通白酒企业和相关科研单位研究的重要课题。国内大部分研究都是通过优化发酵工艺、蒸馏工艺和勾兑技术使白酒中高级醇和酯的构成及量比关系达到最理想的状态，导致我国高档白酒存在耗粮高、生产周期长、效率低、成本高等问题。而构建高产酯低产高级醇酿酒酵母工程菌株，才可以从根本上解决酯含量较低而高级醇含量较高的问题，也是工业微生物育种的发展方向。

酿酒酵母在白酒发酵过程中生成酒精的同时，产生了一定量的高级醇以及少量的酯类。研究表明，ATF1基因编码的醇乙酰基转移酶是乙酸乙酯、乙酸异戊酯等乙酸酯类合成的关键酶，并存在于细胞膜上，该酶催化醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯。Lilly等人用工业菌株过表达ATF1，用葡萄汁发酵培养基进行发酵，葡萄酒中的乙酸乙酯浓度提高了3-10倍，乙酸异戊酯浓度提高了4-12倍。IAH1基因编码乙酸异戊酯水解酶，对清酒的研究发现，IAH1基因缺失的清酒酵母菌株所产乙酸异戊酯的浓度远高于野生清酒酵母菌株，乙酸异丁酯的产量较野生清酒酵母菌株也有增加。采用分子育种技术提高调控酯合成的酶活性，减弱或抑制调控酯分解的酶活性，是提高酯生成量有效的措施。在生成高级醇的氨基酸分解代谢途径中，由BAT2基因编码的氨基酸转氨酶的缺失可以阻断或减弱氨基酸转变成α-酮酸的量，进而可以减少缬氨酸生成异丁醇和亮氨酸生成异戊醇的量。采用分子育种技术减弱或抑制调控高级醇合成的酶活性，从而切断了或减弱了高级醇代谢途径，是降低高级醇生成量有效的措施。

在高级醇和酯的代谢途径中，醇类与酰基辅酶A可以缩合生成酯，而酵母产生的酯水解酶催化酯水解生成醇类。BAT2基因的缺失通过降低异丁醇、异戊醇等高级醇前体物的量降低高级醇的产量；而ATF1基因的过表达通过提高醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯的量，提高酯类含量的同时进一步的降低了高级醇的含量；IAH1基因的缺失通过降低相关乙酸酯的分解又进一步提高乙酸酯的含量。已有研究通过在啤酒酵母中敲除BAT2基因同时过表达ATF1基因，高级醇总量降低了27.3％，乙酸酯提高了6.96倍。

公布号为201110094875.9的中国发明专利通过在黄酒酵母中敲除IAH1基因同时过表达ATF1基因，乙酸乙酯产量提高了20.9倍，乙酸异戊酯和乙酸异丁酯也有提高，同时异戊醇降低了49％。在白酒和黄酒高产酯低产高级醇酵母菌株选育的相关研究中，尚没有同时调控高级醇代谢和酯代谢相关关键基因的报道。

因此，本发明通过完全敲除氨基酸转氨酶编码基因BAT2的和乙酸异戊酯水解酶编码基因IAH1，同时两次过表达醇乙酰基转移酶编码基因ATF1，选育高产酯低产高级醇酿酒酵母工业菌株，满足酿酒酵母应用相关领域对酵母的较高要求，为白酒行业带来显著的经济效益。

发明内容：

本发明解决的技术问题之一是提供一株高产酯低产高级醇酿酒酵母。

所述高产酯低产高级醇酿酒酵母是在出发酵母菌株中完全敲除编码氨基酸转氨酶的BAT2基因和编码乙酸异戊酯水解酶的IAH1基因，同时两次强启动子PGK1过表达编码醇乙酰基转移酶的ATF1基因所得。

所述BAT2基因其GeneID为：853613，核苷酸序列如序列表中SEQNO:1所示；

所述IAH1基因其GeneID为：854293，核苷酸序列如序列表中SEQNO:2所示；