[发明专利]一种造礁石珊瑚总RNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种造礁石珊瑚总RNA提取方法。

背景技术

珊瑚礁是地球上的生物多样性最高生态系统之一，珊瑚礁生态系统不仅为人类的生产和生活提供各种生物资源，而且具有巨大的生态功能和生态价值，对保障生物多样性、生物生产力和生态平衡具有重要作用。然而近年来，世界范围内的珊瑚白化死亡现象日益频繁，严重时导致珊瑚礁的退化。研究珊瑚白化机理不仅要了解珊瑚外在生理响应，更要深入认识引起这些变化的内在分子机制。造礁石珊瑚的种类繁多，有七十多属。获取高质量的造礁石珊瑚总RNA是进行分子机制研究的首要条件。RNA的质量好坏决定着可被反转录为cDNA的最大序列信息，特别是对于体内生活着大量微生物及虫黄藻的复杂造礁石珊瑚共生体。要获得大量完整、纯度高的总RNA，首先要清除珊瑚体内的虫黄藻、微生物等的影响，其次要对造礁石珊瑚组织进行充分完全地破碎，还要抑制RNA酶的降解作用，从而获得高质量的总RNA。

目前常用的RNA提取方法多用于植物、动物组织的提取，并非适用于造礁石珊瑚，且这些方法通常存在RNA得率和纯度较低的问题，难以进行下一步的分析。

目前，尚无造礁石珊瑚总RNA提取方法的专利及其他文献资料。

发明内容

本发明的目的是为解决现有技术中没有适用于造礁石珊瑚的RNA提取方法的问题，提供一种造礁石珊瑚总RNA提取方法；利用该方法提取的造礁石珊瑚RNA纯度高、质量好，极大的减少了造礁石珊瑚RNA损耗和降低了DNA污染，能适用于后续RT-PCR等分子生物学实验的要求。

本发明的造礁石珊瑚总RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和预处理、用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入异丙醇沉淀RNA，弃上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚总RNA，其特征在于，

所述的造礁石珊瑚的采集和预处理是用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA是将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解释放出RNA；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的水饱和酚(酸性水饱和酚，可以从试剂公司直接购买)、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为无RNA酶的水(RNase-free水)。

所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其具体步骤为：

a、用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

b、将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解，振荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心5min，取上清液；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水；

c、按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心15-20min；离心后溶液分3层，取出上层水相，按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀10min后12000g离心10min；弃上清，加入余下溶液等体积的无水乙醇，混匀，4℃、7500g离心5min；弃上清，干燥5-10min，得到造礁石珊瑚总RNA，将该RNA溶于RNase-freewater中-70～-80℃保存。

优选，所述的造礁石珊瑚为鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黄滨珊瑚。

优选，所述的步骤a的无菌海水是经高温灭菌且经0.22μ微孔滤膜过滤的海水。用无菌海水冲洗造礁石珊瑚体表，是为了去除珊瑚体表的其它附着的生物对造礁石珊瑚RNA提取的影响。

优选，所述的步骤b的造礁石珊瑚粉末与异硫氰酸胍裂解液用量比为3g:1ml；此比例下提取效果最佳，造礁石珊瑚过少会导致RNA浓度过低；造礁石珊瑚过多会导致裂解不完全，内源性酶降解RNA严重。

优选，所述的步骤b和c的振荡混合为剧烈振荡15s。

优选，还包括以下步骤：在步骤c的按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心15-20min后，再重复该操作2-3次；这样处理后沉淀去除蛋白质的效果更好。