[发明专利]一种基于二聚化的受体结合区亚单位的冠状病毒疫苗

说明书

本发明公开了一种基于二聚化的受体结合区亚单位的冠状病毒疫苗，属于医药技术领域。本发明通过杆状病毒体在昆虫细胞里表达MERS‑CoV蛋白的RBD(E367‑Y606)区域和ARS‑CoV的RBD(R294‑F515)，使得RBD可通过S蛋白自身603位的半胱氨酸残基形成二聚体或者通过S蛋白自身512位的半胱氨酸残基形成二聚体，分别使用纯化的RBD蛋白二聚体和单体对Balb/c小鼠进行免疫。本发明的二聚化的RBD克服了RBD单体免疫原性不足的缺点，大大提高了小鼠针对MERS‑CoV的中和抗体产生。

技术领域

本发明涉及一种基于二聚化的受体结合区亚单位的冠状病毒疫苗，属于医药技术领域。

背景技术

冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，是有囊膜的正链RNA病毒，在所有RNA病毒中其基因组最大。动物和人类都是冠状病毒的宿主。冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的呼吸道和消化道。其中有6种冠状病毒感染人。其中对全球公共卫生威胁最大的是2002-2003年在中国爆发的严重呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和2012年爆发并持续至今的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。冠状病毒也引发许多严重的动物疾病，尤其对农业牲畜和宠物带来严重威胁。比如，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)可以引发猪的严重腹泻，死亡率极高；其缺失病毒猪呼吸道冠状病毒(PRCV)可以引起猪严重的呼吸道疾病；猫腹膜炎病毒(FIPV)可引起猫腹膜炎和腹水聚集，致死率很高；犬冠状病毒(CCoV)则可使犬发生不同程度的肠胃炎症状，传播快，难控制；猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪流行性腹泻等肠道疾病，容易在猪群里传播致死率很高。此外还有鼠、牛等冠状病毒。这些冠状病毒对人和动物的健康造成了严重的威胁。因此，开发一种安全、有效的针对冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗十分紧迫、有着重要的意义。

表面刺突蛋白(S蛋白)是冠状病毒的主要中和抗原。MERS-CoV、SARS-CoVS蛋白的受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。MERS-CoV通过RBD与宿主细胞的受体(CD26，又名DPP4)结合而侵入细胞。此外，SARS-CoV通过其RBD与宿主细胞受体ACE2结合而进入细胞。

目前已有报道的通过使用冠状病毒RBD制备针对MERS-CoV和SARS-CoV的疫苗，使用的是单体的RBD蛋白或者融合单体RBD与Fc区的蛋白。在MERS-CoV里面，之前报道的RBD单体仅能在小鼠体内激起较低的假病毒中和抗体水平。这提示使用MERS-CoV的RBD单体作为疫苗的免疫原性有限。因此有必要对基于MERS-CoVRBD的疫苗进行改进。之前又有报道通过在RBD的C末端融合IgG的Fc区域，表达制备RBD-Fc用于针对MERS-CoV的疫苗。RBD-Fc能够诱导产生较高的假病毒中和活性。但蛋白融合表达Fc作为疫苗其安全性还需要许多深入的研究评价，限制了其临床使用的进度。

此外，之前SARS-CoV疫苗的研究也使用的是RBD单体，具有一定的中和免疫原性。

总之，目前基于冠状病毒S蛋白的RBD单体研制的疫苗，免疫原性有限。而基于RBD的融合蛋白(比如IgG的Fc段)则存在安全评价不足的缺陷。因此，开发一种免疫原性高、安全性更被认可的SARS-CoV或MERS-CoV疫苗，是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明开发了一种基于冠状病毒RBD设计疫苗的新方法，利用MERS-CoV、SARS-CoV自身的半胱氨酸残基形成同源二聚体来制备疫苗，本发明的疫苗能显著的提高宿主中和抗体的水平，制备方法简单、蛋白无标签且易于纯化，能较快的应用于临床的使用。

本发明的第一个目的是提供一种免疫原性提高的冠状病毒抗原，所述抗原是二聚化的MERS-CoV蛋白或者SARS-CoV蛋白的RBD。