[发明专利]一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化领域，特别涉及一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法。

背景技术

蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，最常见的是半胱氨酸，蛋白质对溶液pH、空气中的氧等外界因素都较为敏感，容易发生结构的转变，影响活性。

钙调磷酸酶(Calcineurin,CN)是目前所知唯一一种依赖Ca²⁺/CaM(钙调素)的蛋白磷酸酶，由A，B亚基以1：1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，B亚基(CNB)是调节亚基。CN在免疫激活通路中发挥重要作用，示T细胞活化的关键没。CN作为大分子酶蛋白，易失活，不稳定，而CNB作为该酶的调节亚基，能促进CAN的活性，且相对分子质量小，性质稳定。由研究表明CNB能刺激T细胞和NK细胞增殖以及增强NK细胞的杀伤活性，增强巨噬细胞吞噬能力等免疫功能，且重组人钙调磷酸酶B亚基(RecombinanthumanCalcineurinBsubunit,rhCNB)是开发中的基因工程创新肿瘤药物。

rhCNB具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，单体是一种含有巯基结构的蛋白，主要成分为rhCNB二聚体，含有少量单体和多聚体，在生产、放置等过程中，易受温度、pH值、氧化等因素影响形成多聚体结构，造成各组分比例不稳定。影响质量指标纯度的控制。

因此，提供一种有效检测重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法。本发明对rhCNB原液进行系统适用性试验、方法的专属性、耐用性均符合验证可接受标准，验证通过。本方法适合于rhCNB原液中纯度的测定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法，包括如下步骤：

步骤1：取rhCNB原液制备获得供试品溶液；

步骤2：取所述供试品溶液经反相高效液相色谱法测定rhCNB的纯度；

所述反相高效液相色谱法的流动相包括：

A相：0.1％(v/v)三氟乙酸-水；B相：0.1％(v/v)三氟乙酸-乙腈；

所述流动相梯度洗脱配比为：

A相：65％→5％、B相：35％→95％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述rhCNB原液的制备方法为：rhCNB工程菌经种子扩增、表达培养、得到有rhCNB表达的湿菌体。湿菌体经破碎、离心分离，得到蛋白含量不低于0.5％的离心分离上清液。将离心分离上清液经疏水层析、DEAE层析得到rhCNB粗纯化液。再经氧化、分子排阻色谱分离得到高纯度终纯化液。高纯度终纯化液经除菌过滤，得到rhCNB原液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的流动相梯度洗脱的流速为1.2～1.5mL/min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的流动相梯度洗脱在24分钟内B相从35％→95％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的检测波长为214-280nm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的检测温度为25℃～30℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的固定相为丁基硅烷键合硅胶。

在本发明的一些具体实施方案中，所述供试品溶液的蛋白质含量为2.0mg/ml。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的空白对照溶液为枸橼酸盐溶液；所述枸橼酸溶液的制备方法为称取枸橼酸0.252g、枸橼酸钠2.59g，加水适量溶解，再加水稀释至1000ml。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法中重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基峰理论塔板数不低于5000。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的所述流动相A相溶液的制备方法为量取1.0mL三氟乙酸加水至1000mL；所述流动相B相溶液的制备方法为量取1.0mL三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000mL。