[发明专利]一种快速检测痰液中结核分支杆菌的试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测痰液中结核分枝杆菌的探针，其特征在于：所述探针为分子信标探针， 该分子信标探针由茎环结构两部分组成，总长度25~50个碱基，其中中间的环序列部分与细 菌中核糖体RNA（16srRNA、23srRNA等）序列相匹配，两端茎序列部分为5~10个碱基互补的 DNA序列，分子信标探针的5'-端用荧光基团标记，3'-端用荧光淬灭基团标记，在常温、游离 状态下分子信标探针可自动退火形成发夹结构，荧光基团与荧光淬灭基团由于距离较近而 不发出荧光信号，只有当分子信标探针中环序列部分与靶序列特异性结合之后，荧光基团 与荧光淬灭基团彼此分离，进而发出荧光信号；所述探针是通过核酸杂交的原理检测痰液 中的结核分枝杆菌，

结核分枝杆菌分子信标探针序列〈SEQIDNo.1〉为：

5’-TXR-CACGCACGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGTGCGTG-DABCYL-3’。

2.一种用于检测痰液中结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）权利要求1所述的探针；

（2）液化液；

（3）裂解液；

（4）终止液；

（5）固定液。

3.根据权利要求2所述的用于检测痰液中结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述液 化液包括：1%(w/v)PEG，0.6mMDTT，13.4mMNaCl，0.3mMKCl，1mMNaH₂PO₄，0.1mM KH₂PO₄，50mMEDTA，0.1%(v/v)TritonX-100，50mMTrisHClpH8.0；

所述裂解液包括：5M盐酸胍，0.2mMDTT，50mMEDTA，0.5%(w/v)过硫酸铵，0.1%(v/ v)TritonX-100，10mMTrisHClpH7.0；

所述终止液包括50mMTrisHClpH10.0，0.5MNaCl，0.1%(v/v)NP-40，0.5%(v/v) TritonX-100；

所述固定液包括：5%(w/v)甘油，0.2mMDTT，25mMNaCl，0.3mMKCl，0.6mM NaH₂PO₄，0.6mMKH₂PO₄，50mMEDTA，10mMTrisHClpH7.0。

4.一种采用如权利要求3所述试剂盒的用于检测痰液样本中结核分枝杆菌的方法，其 特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)取待检痰液样本，加入到液化液中，样本与所述液化液的体积比为1:1~1:10，震荡 混匀；

(b)取按步骤(a)操作获得的液体5~10ul滴至载玻片上，50~65℃烘干5~10min；

(c)将按步骤(b)操作获得的载玻片浸入乙醇中5~10min，50~65℃烘干5~10min；

(d)在按步骤(c)操作获得的载玻片加样孔中加入探针5~10ul，置于加热板中50~65℃ 避光烘干5~10min；

(e)将按步骤(d)操作获得的载玻片浸入终止液中1~60sec，置于加热板中50~65℃烘 干5~10min；

(f)在按步骤(e)操作获得的载玻片加样孔中加入固定液5~20ul，加盖盖玻片，用荧光 显微镜镜检观察，用10×物镜观察计数，用40×或100×物镜观察细菌形态；

(d)在按步骤(c)操作获得的载玻片加样孔中加入探针5~10ul，置于加热板中50~65℃ 避光烘干5~10min；

(e)将按步骤(d)操作获得的载玻片浸入终止液中1~60sec，置于加热板中50~65℃烘 干5~10min；

(f)在按步骤(e)操作获得的载玻片加样孔中加入固定液5~20ul，加盖盖玻片，用荧光 显微镜镜检观察，用10×物镜观察计数，用40×或100×物镜观察细菌形态。