[发明专利]一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2 T细胞制备方法

权利要求书

1.一种一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，包括以下步骤：

步骤1）：采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得人外周血单个核细胞；

步骤2）：将分离的PBMCs置于含有刺激剂结核杆菌耐热性抗原，细胞因子rhIL-2和5-10%自体血浆的RPMI1640培养基中；同时加入rhIL-125-20ng/ml、PD-1抗体0.5-10ug/ml对PBMCs进行培养；

步骤3）：每隔2-3天根据细胞生长情况补加新鲜RPMI1640培养基；

步骤4）：根据细胞生长情况，第10-16天收集细胞，即得到高毒性Vγ9Vδ2T细胞。

2.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，具体包括以下步骤：采集患者外周静脉血，300-500grp，离心5-7分钟，吸取血浆层，56℃灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，600-680grp，离心15-20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2-3次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。

3.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2中，初始培养的PBMCs的密度为1-2×10⁶cell/ml。

4.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2中，刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为500-1500IU/ml。

5.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2中，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1抗体的浓度为0.5-10ug/ml。

6.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3中，新鲜RPMI1640培养基中含有5-20ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体以及500-1500IU/ml的IL-2。

7.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3中，控制补液后细胞的密度在1-2×10⁶cell/ml。

8.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所得到的Vγ9Vδ2T细胞的纯度在70%以上。