[发明专利]重组蓖麻毒素B链截短蛋白及其表达方法和应用

权利要求书

1.重组蓖麻毒素B链截短蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的重组蓖麻毒素B链截短蛋白，其特征在于，蓖麻毒素B链蛋白基因中具有9个半胱氨酸，将蓖麻毒素B链蛋白的氨基酸序列中前五位氨基酸截短，得到蓖麻毒素B链截短基因序列，并用该蓖麻毒素B链截短基因序列进行蛋白质重组表达，从而获得重组蓖麻毒素B链截短蛋白。

3.如权利要求1所述的重组蓖麻毒素B链截短蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)大肠杆菌表达工程菌BL21(DE3)/PET28a-RTB的获得

在氨基酸序列不变的条件下，根据已有的蓖麻毒素B链序列进行密码子优化，并通过人工合成蓖麻毒素B链密码子优化后的全序列，其核苷酸序列为序列表中的序列1，其氨基酸序列为序列表中的序列2；

以蓖麻毒素B链密码子优化后的全序列为模板，用rRTB sense primer和rRTB anti-sense primer进行PCR扩增，获得的PCR产物连接至pMD18-T克隆载体，获得pMD18T-RTB；

所述rRTB sense primer的序列见序列表中的序列3，所述rRTB anti-sense primer的序列见序列表中的序列4；

双酶切pMD18T-RTB和PET-28a表达载体，将酶切产物链接并转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经筛选获得阳性菌BL21(DE3)/PET28a-RTB，提取质粒PET28a-RTB并测序；该质粒为序列表中的序列1插入PET28a表达载体的EcoR I和Hind III的酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为PET28a-RTB；

步骤(1)中，PCR扩增条件为：预变性94℃：5min、变性：94℃30s、退火：60℃30s延伸：72℃45s共扩增25循环；

(2)重组蓖麻毒素B链截短蛋白的诱导表达与纯化

将阳性菌BL21(DE3)/PET28a-RTB按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100ug/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100ug/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mM，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀；

用大肠杆菌细菌裂解试剂盒裂解菌体沉淀，离心获得包涵体沉淀；将包涵体沉淀用8M尿素溶解后加2X SDS-PAGE上样缓冲液，100℃下煮沸5min，吸取样品进行SDS-PAGE电泳；经12％SDS-PAGE电泳分析，重组蓖麻毒素B链截短蛋白在包涵体有特异性的表达，且其蛋白分子量为38Kd，与预期的蛋白大小相符合；

步骤(2)中，所述2X SDS-PAGE上样缓冲液包括：pH6.8的100mmol/L Tris·Cl、200mmol/mL DTT、4％SDS、0.2％溴酚蓝和20％甘油；

步骤(3)：将步骤(2)获得的包涵体溶解液进行亲和层析，亲和层析柱为cOmplete His-Tag Purification ResinNi²⁺，洗脱液为含500mM咪唑的8M尿素，当咪唑浓度升至300mM时，收集洗脱峰即为纯化后的重组蓖麻毒素B链截短蛋白。

4.如权利要求1所述的重组蓖麻毒素B链蛋白作为制备疫苗佐剂中的应用。