[发明专利]一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法

说明书

本发明公开一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：一，对外植体进行清洗、消毒，然后接入诱导培养基中进行诱导培养；二，将步骤一中诱导的原球茎接入液体增殖培养基中进行悬浮震荡培养；三，将步骤二中获得的原球茎转接到分化培养基中培养获得分化苗；四，将步骤三中1‑2cm高的苗转接到生根培养基中生根。本发明可以提高增殖倍率，实现产业化快速繁殖，该方法培育的铁皮石斛原球茎分化率高，干重鲜重含量提高，移栽成活率相应提高。

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)是兰科石斛属多年生附生草本植物，是我国名贵的传统中药材之一，也是一种重要的花卉植物，分布于我国南方浙江、广西、福建、贵州、云南、安徽等省的原始森林中，有益胃生津，滋阴清热，止咳润肺等功效。由于生长环境特殊，长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材。同时，铁皮石斛的种子极小，无胚乳，自然条件下需与真菌共生才能萌发，繁殖速度慢，长势不一且变异率高。

20世纪70年开始，铁皮石斛的研究工作在组织培养、种植、药理药效方面发展很快，但在铁皮石斛的组织培养中存在组培苗生产成本高，移栽成活率低等问题。铁皮石斛原球茎是铁皮石斛离体培养产生的组织，具有植株的物质代谢和形态发育的潜能。一方面，铁皮石斛原球茎可以分化成苗，培养成植株，或者作为人工种子繁殖体解决试管苗移栽的问题，另一方面可以从原球茎中直接提取有效的药用成分，代替野生或栽培的植株。然而，铁皮石斛原球茎通过固体培养进行增殖，50-60天继代一次，周期长增殖倍率不高，长势不均匀。

有鉴于此，本发明研发出一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，以提高增殖倍率，实现产业化快速繁殖，该方法培育的铁皮石斛原球茎分化率高，干重鲜重含量提高，移栽成活率相应提高。

为达成上述目的，本发明的解决方案为：

一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

一，对外植体进行清洗、消毒，然后接入诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基配比为：MS培养基，6-BA 0.1mg/L，NAA 0.3mg/L，100g/L土豆泥，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度1500-2000lux，光照时间10h，温度25±2℃；

二，将步骤一中诱导的原球茎接入液体增殖培养基中进行悬浮震荡培养，液体增殖培养基为：1/2MS培养基，6-BA 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖30g/L，PH5.6-5.8，培养条件为采用工业摇床进行悬浮震荡培养，转速100r/min，光照强度2000-2500lux，光照时间8h，温度25±2℃；

三，将步骤二中获得的原球茎转接到分化培养基中培养获得分化苗，培养基配方：1/2MS培养基，6-BA 1.5-2.0mg/L，NAA 0.3-0.5mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃；

四，将步骤三中1-2cm高的苗转接到生根培养基中生根，生根培养基配比：1/2MS培养基，NAA 1.0mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃。

进一步，步骤一中，选择长势旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条为外植体，去除所有叶片，切除顶芽，然后将外植体放入含洗衣粉的水中浸泡10min，清水冲洗干净转移至无菌操作台上，用质量浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用质量浓度为0.1％的生汞消毒7-8min，无菌水冲洗5次，沥干，将茎段切成2-3cm带节的茎段，接种到诱导培养基中。