[发明专利]用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种用于检测 莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法。

背景技术

莱姆病(Lymedisease)是由伯氏疏螺旋体(Bolreliaburgdorferi)引 起的一种慢性自然疫源性疾病。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在 宿主动物与宿主动物及人之间传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮 肤损害--慢性游走性红斑(ECM)，同时伴有头痛、发热、寒战、疲乏 不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运 动系统等呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、 病死率较高等特点。如能早期诊断、早期治疗常可痊愈，否则会出现 严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技术，对莱姆病 早期诊断、早期治疗具有重要的意义。

目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。 病原学检测包括直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(PCR)和 荧光定量PCR(real-timePCR)；常用的特异性抗体检测包括间接免疫 荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹法 (WB)。

直接镜检法需要操作者具备丰富的检验经验，然而对于混合感染 的情况，则无法检测到，而且该法容易漏检，与其他诊断方法相比， 直接检查的检出率相对较低。病原分离培养法的分离率低，耗时较长， 敏感性差。IFA只能检测到菌体表面的抗原，灵敏度和特异性都比较 低，且IFA受实验因素影响大，易造成假阳性或假阴性。ELISA主要 对莱姆病特异抗体IgG进行检测，传统ELISA检测方法，存在非特异 反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易误诊。WB可以判断和验证 IFA和ELISA的真假阳性，但由于莱姆病螺旋体有不同的致病基因型， 而这几种基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各国应根据实际 情况，制定出针对本国流行的基因型的WB阳性诊断标准，而且WB 的操作比较复杂，不利于推广。PCR技术的不足之处在于：(1)靶基因 易被污染；(2)易出现非特异性扩增；(3)扩增反应易受多种因素的影 响；(4)需要投入比较昂贵的精密仪器(如PCR仪、凝胶电泳仪及凝胶 成像系统)；(5)耗时长，需要2～3h的反应时间和1～2h的电泳时间。这 些均不利于现场的快速检测，给技术的基层推广造成了极大障碍。

重组酶聚合酶扩增法(RecombinasePolymeraseAmplification, RPA)是2014年兴起的一种新的恒温扩增方法，其特点是在等温条件 下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶基因序列。目前RPA技 术主要应用于病原微生物的快速检测，包括病毒、细菌、真菌、支原 体、寄生虫等，在临床疾病诊断、食品卫生检验及环境监测方面应用 广泛，然而目前未见利用RPA技术进行莱姆病螺旋体检测的相关报 道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和 探针以及含有所述引物和探针的检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种检测莱姆病螺旋体的RPA法。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测莱姆病螺旋体的 RPA引物和探针，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引 物序列如下：

LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’

LF-R:5’-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’

所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM 标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行 dSpacer或THF修饰。

引物和探针序列分别如下：

LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’

LF-R:5’-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’

LF-P: 5’-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAG GAGGCAT(C3Spacer)-3’