[发明专利]快速区分仿刺参来源地的随机扩增多态性DNA方法及实现所述方法的引物

说明书

本发明涉及通过随机扩增多态性DNA技术对三种不同来源地的仿刺参进行快速鉴定、区分的方法。本发明提供实现上述方法的对仿刺参进行RAPD扩增的引物、含有所述引物的试剂盒，还涉及一种快速检测仿刺参来源地的随机扩增多态性DNA方法，通过提取待测样品的DNA模板，通过如SEQ No.1所示的引物D20为随机引物进行PCR反应，然后对PCR反应产物进行电泳检测。本发明通过RAPD技术实现仿刺参来源地的快速检测，克服了现有技术鉴定仿刺参时存在的成本高、费时长等缺点。本发明只需进行一次PCR反应和一次琼脂糖凝胶电泳即能分辨大连、威海、烟台的仿刺参，具有低成本、灵敏度高的优点。

【技术领域】

本发明属于分子生物学领域，涉及海参的分子生物学鉴定，特别是通过随机扩增多态性DNA对三种不同来源地的仿刺参进行快速鉴定的方法。

【背景技术】

海参是棘皮动物门海参纲动物的统称，是名贵海味并具有重要的药用价值。其中，仿刺参(Apostichopus japonicus)俗称辽参，属于楯手目、刺参科、仿刺参属，是我国经济价值最高的海参品种。种群主要分布于辽、冀、鲁、苏等北方沿岸浅海区，在日本北海道、俄属海参崴、朝鲜半岛也有生长。然而，商业利益也催生了如掺假、造假等不法行为，特别是譬如伪造产地、以次充好等，所以对市面上所销售种类繁多的海参进行物种分类和来源地鉴定势在必行。

目前，鉴定海参种类及产地的方式主要有形态学鉴定、物理学方法鉴定、化学方法鉴定以及分子生物学方法鉴定。其中传统鉴定方法过程繁琐复杂、耗时耗力、准确性低，难以适应现代工业的鉴定要求。

分子生物学方法以核酸为研究对象，具有特异性好、灵敏度高、耐热性强等优点，利用DNA条形码技术对海参物种进行鉴定，例如线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(Mitochondrial cytochrome coxidase subunitⅠ，COⅠ)由于存在显著的序列变异而被认为是一种合适的DNA分子标记。

例如中国专利申请CN 201410010808.8公开了一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其通过分子生物学方法基于COI基因对样品基因片段进行PCR-RFLP反应，结合电泳检测和谱带判断海参样品的品种。然而，该方法只能检测海参的品种，而对于同品种的海参却无法分辨其来源地。

至于海参产地的鉴别研究，现代技术利用近红外光谱法、ICP-MS进行研究，但上述方法的特点是操作复杂，成本较高，且一般实验室难以开展，故亟需发明一种简单易行且准确的鉴定方法。

随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)技术是由美国科学家Williams、Welsh等于1990年提出的一项DNA多态性分析技术。其原理是采用短的单一引物，一般约为10个碱基，通过PCR反应对目标生物的基因组DNA进行扩增，然后用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，产物的电泳条带在数量、大小位置、明暗等方面表现出很强的特异性，反映出目标生物基因组DNA的多态性。

【发明内容】

本发明的目的是对来自大连、威海和烟台的仿刺参进行快速来源地检测。

为了实现上述目的，本发明提供对仿刺参进行RAPD扩增的引物，所述引物序列如SEQ No.1所示。

本发明还提供含有上述引物的快速检测仿刺参来源地的试剂盒。

本发明还涉及采用随机扩增多态性DNA的快速区分仿刺参来源地的检测方法，包括以下步骤：

(1)对每一份仿刺参分别取待测样品，提取DNA模板；

(2)分别以待测样品DNA为模板，如SEQ No.1所示的引物D20为随机引物进行PCR反应；

(3)对PCR反应产物进行电泳凝胶检测；