[发明专利]骨髓干细胞的保存及运输方法

说明书

本发明公开了一种骨髓干细胞的保存及运输方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：按临床常规取得红骨髓；将骨髓加入5倍体积的PBS，离心，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入PBS轻匀制得悬液；将含海藻糖的分离液加入到离心管中，悬液平铺到分离液上，离心，吸取白膜层细胞；将细胞与冻存液等比例混合分装于冻存管中；先‑80℃冷冻，后转入液氮中冻存；从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，离心收集骨髓干细胞；在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。本发明使细胞在运输过程中保持活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种骨髓干细胞的保存及运输方法。

背景技术

骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫细胞，包括干细胞、淋巴细胞等，在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的干细胞。目前主要是利用低温冻存技术保存干细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但在分离、冻存过程中，会对干细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。

另一方面，骨髓中含有较多的脂肪，影响分离效果，不能获得足够的干细胞，再加上冻存过程中对细胞产生的损伤，使免疫细胞冻存复苏后的存活率不高。细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的干细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。现有技术中，利用淋巴细胞分离液分离干细胞的效果不是很好，而且常规的Ficoll 400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用。

因此，有必要提供一种能够有效提高干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的提取方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效提高干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的骨髓干细胞的保存及运输方法。

为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

一方面，提供一种骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：

1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；

2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；

3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，所述骨髓细胞悬液平铺到所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；

4)将所述骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将所述冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；

5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；

6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×10⁶细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。