[发明专利]一种头孢菌素C酰化酶固定化酶制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种头孢菌素C酰化酶固定化酶的 制备方法。

背景技术

由于头孢菌素类抗生素过敏反应小，对β-内酰胺酶较稳定，具有抗菌谱 广、疗效好、毒性低、同其他抗生素无交叉耐药性、与青霉素较少产交叉过 敏反应等优点，近年来已经成为抗感染最重要的有效药物。头孢菌素C (CephalosporinC，CPC)经化学法或是酶法裂解得到7-ACA。化学合成 反应由于过程长、步骤多、反应条件苛刻、产生大量的三废等弊端，目前已 被淘汰。目前主要使用两步酶法制备7-ACA。首先，头孢菌素C在含有氧气 情况下被D-氨基酸氧化酶(D-aminoacidoxidase，DAAO)催化，产生具有 酮基的中间体(ketoadipyl7-aminocephalosporanicacid，keto-7-ACA)和H₂O₂。 这个中间体较不稳定，很容易被同时产生的H₂O₂氧化脱羧，转变成戊二酰基 -7-氨基头孢烷酸(glutaryl7-aminocephalosporanicacid，GL-7-ACA)，然后 GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶(GL-7-ACAacylase)的作用下脱去其侧链， 生成7-ACA。但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且 D-氨基酸氧化酶(D-aminoacidoxidase，DAAO)催化反应难以控制。头 孢菌素C酰化酶(CPCacylase)可以直接把头孢菌素C转变成7-ACA(不经过 GL-7-ACA等中间产物)，利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具 有化学法高转化率、高纯度的优势，也具有两步酶法高经济性和环境保护的 优势。

由于野生菌株培养困难或酶活较低，而且往往存在导致底物及产物降解 的β-内酰胺酶和酯酶，因此人们将酰化酶进行了克隆和表达。利用基因工程 发酵生产具有周期短、成本低、过程易于控制等诸多优点，且由于发酵培养 基组分简单、酰化酶基因可受启动子基因调控，使其具备易纯化和可诱导高 产的特点。而将纯化获得的头孢菌素C酰化酶制备成固定化酶后，则可以重 复使用，节约成本，提高效益，因此对于酰化酶固定化技术的研究具有重要 的意义。

发明内容

本发明的目的在于简化7-ACA生产的过程，提供一种头孢菌素C酰化酶 固定化酶制备方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种头孢菌素C酰化酶固定化酶制备方 法，所述方法包括以下步骤：

(1)发酵培养头孢菌素C酰化酶生产菌并在发酵结束后收集获得发酵 菌体；将发酵菌体与磷酸钾缓冲液接触混匀后进行破碎离心，收集离心上清 液作为酶液；

(2)在酶液中加入硫酸铝获得硫酸铝终浓度为0.001-0.01g/L的混合液 1；将所述混合液1在40-50℃下加热30-60min后去除不溶物，获得混合液2；

(3)将所述混合液2与载体接触搅拌进行固定化反应获得固定化酶。

优选的，所述头孢菌素C酰化酶生产菌为大肠杆菌基因工程菌 CPCA2013，保藏号为CGMCCNo.9285。

其中，在步骤(1)中可以利用离心的方法收集菌体。可以利用高压均 质的方法对菌体进行破碎，高压均质的条件可以为在850-900Mpa操作压力下 破碎3次，使细胞破碎率达到90％，破碎结束后再在8000-12000rpm下离心 15-25min去除不溶部分。

优选的，在步骤(1)中磷酸钾缓冲液的pH值为7.8-8.2，浓度为0.1M； 所述酶液的固含量为20-25％。

优选的，为了获得更高的酶活以及增加重复利用次数，所述混合液1中 硫酸铝的终浓度为0.007-0.01g/L。

优选的，固定化反应的条件为将所述混合液2与载体在20-30℃下接触 搅拌20-50h。

优选的，所述载体为环氧树脂。在本发明的一种优选的实施方式中，所 述环氧树脂可以为西安蓝晓科技新材料股份有限公司生产的环氧树脂Seplite LX-1000EP。

优选的，所述载体为经过磷酸盐缓冲液洗涤处理后的环氧树脂。具体的， 可以用磷酸盐缓冲液洗涤载体2-3次，每次洗涤4-6min。

优选的，相对于每升所述酶液，载体的用量为100-200g。