[实用新型]一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置

说明书

技术领域

本实用新型属于氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性测定技术领域，具体涉及一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置。

背景技术

厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的微生物，且不能直接暴露在含氧量大于或等于18%的空气里，对氧气敏感，一般可分为绝对厌氧菌和兼性厌氧菌两类。厌氧菌属于较为古老的原核菌进化而来，目前不断发现较多的厌氧菌特别是绝对厌氧菌具有很大的发酵应用和工业生产价值，如Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium strain P11、Clostridium ljungdahlii和Clostridium autoethanogenum DSM10061等。此类厌氧菌能够利用乙酰CoA/Wood-Ljungdahl代谢途径行使生命活动进行生长繁殖，另外研究证明该类菌的代谢物还可作为人类所需要的生物燃料或原料，如乙醇、丁醇和脂类等。

氢化酶(hydrogenase，简称H₂ase)是一类存在于微生物尤其是厌氧菌体内的重要生物酶，是一种催化伴有氢分子释放或分子氢转化质子的氧化还原反应酶，它通过控制微生物体内氢的代谢来调节细菌的其他生理活动。

一氧化碳脱氢酶(CO dehydrogenase,简称CODH)是一类存在于能够利用CO或CO₂的绝对厌氧菌内，是该类菌利用CO或CO₂作为碳源进行生命活动的关键性酶，它可催化CO氧化为CO₂，也可还原CO₂为CO，在CO氧化过程中不仅为厌氧菌提供了碳源还提供了代谢所必需的还原力。

氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定均对环境氧含量要求严格，如Peters在研究H₂ase结构和性质时发现极微量的氧气都会对该酶活性产生抑制作用。Diekert和Thauer首先在厌氧乙酸菌中发现CO脱氢酶，但由于CODH对氧极端敏感，几年之后才得以纯化此酶。同样，因为两种酶对环境的要求较高而使得目前该两种酶的活性测定方法较少，主要包括：超声波法、酶法和全细胞法，而不同测定方法优缺点不同，已有的测定方法报道如下：

超声波法：该方法测定酶活的主要原理是利用超声波对厌氧菌菌体细胞的作用使得细胞膜破裂进而释放细胞内的氢化酶和一氧化碳脱氢酶，再将破碎液高速离心得到上清液（含粗酶溶液），最后进行酶活体系反应获取酶活大小。该法应用较为广泛，但存在许多缺点：首先是超声波法对酶活性损失大，其次是超声过程易于产热且时间较长，一般全过程需要15～20min，均不利于酶的稳定性，最后是该法的超声对象体系内的还原环境难以控制。

酶法：该方法原理为使用溶菌酶分解厌氧菌细胞壁使之形成原生质体，然后经高速离心作用获取粗酶液，进而同反应体系反应获得酶活。该方法中溶菌酶缓冲液处理样品时需于37℃下操作12～24h。虽然处理条件较为柔和，但酶活反应时间长，中间还需多次补加溶菌酶缓冲液弥补因蒸发作用对实验的影响。同样，该方法不适于多样品甚至大批量样品酶活测定。

全细胞法: 该方法的主要原理是利用厌氧菌细胞直接参与酶活体系内进行酶活反应，然后将反应液利用比色皿比色法获得酶活大小。该方法酶活测定过程中需要在厌氧环境内进行，目前主要选择在厌氧箱内操作或者利用4.5mL带盖比色皿内进行，厌氧箱内酶活反应不仅需要大量氮气，同时因为箱体空间的局限性而致使反应的样品量受到限制并且操作灵活性低；利用比色皿进行酶活反应及测定较厌氧箱简化了操作环节甚至增加了操作灵活性，但仍然存在一些缺陷，如密封性差和所需样品量较大，且一般需要样品进行前处理。同样，无论为哪种途径，最终酶活测定均在分光光度计内测定，因分光光度计内最多设置4个插孔并人工手动操作，则不利于数量稍多的样品酶活测定作业。因而有必要来根据厌氧菌实际情况，通过实验研究建立一种有针对性的、快速、灵活、简便、可靠、酶活损失小和样品使用量少的测定方法。这将对测定和评价厌氧微生物内H₂ase和CODH酶活性具有重要意义。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种快速、灵活、简便、可靠、酶活损失小和样品使用量少的直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置。

为实现以上目的，本实用新型采取以下的技术方案：