[实用新型]一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用。

背景技术

鸭肝脏是鸭子的主要消化器官，鸭肝细胞是鸭肝脏的主要功能细胞，许多鸭病原都能引起鸭肝细胞产生病变，所以建立鸭胚肝细胞系能为研究鸭病提供一种载体，在细胞水平研究鸭病。

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病，鸭病毒性肝炎卵黄抗体可以有效预防和治疗此疾病，目前国内是用鸭胚繁殖鸭病毒性肝炎病毒，然后制成抗原，免疫产蛋鸭，用鸭胚繁殖鸭病毒性肝炎病毒成本高，操作过程繁琐。

目前测定鸭病毒性肝炎卵黄抗体采用的方法是中和试验，即将卵黄抗体倍比稀释后，用标准抗原中和，然后接种鸭（鸡）胚，计算半数致死量（LD₅₀），该方法存在成本高，误差较大等弊端，不能准确测定鸭病毒性肝炎抗体的水平。所以有人尝试将利用原代鸭肝细胞建立中和试验的方法，如《鸭胚肝细胞培养的研究》（甘肃农业大学学报，1994年02期）、《鸭肝细胞原代培养方法的建立》（天津医科大学学报，1996年02期）公开了鸭胚肝细胞的分离培养方法。但是原代鸭胚肝细胞的分离培养每次必须用到鸭胚，制作程序繁琐，成本高，容易污染，细胞状态不容易控制。此外，且含有杂细胞，批次之间差异大，细胞病变不明显，所以该方法难以推广。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明采用基因重组技术，将端粒酶逆转录酶基因（hTERT）转染原代鸭胚肝细胞，首次建立制备永生化的鸭胚肝细胞系的方法，制备出永生化的鸭胚肝细胞，且鸭病毒性肝炎病毒可以在细胞上繁殖，有明显病变，用来繁殖的病毒效价高于鸭胚繁殖病毒效价，使用方便，可以用来生产鸭病毒性肝炎抗原。

本发明的主要目的在于提供一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，所述方法包括：（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养所述消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；（2）采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入所述原代培养的鸭胚肝细胞；（3）培养所述转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选所述hTERT阳性克隆；（4）培养筛选的所述hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。

优选地，所述Marker基因为neo基因。

具体地，所述方法包括：①用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，M199培养基培养48小时后，细胞长满单层，建立鸭胚肝细胞原代培养的方法；

②采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的鸭胚肝细胞；

③细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒48小时，细胞贴壁且状态良好，加450μg/ml G418筛选，第4天细胞开始死亡，后每3天换一次培养基且加入450μg/ml G418继续筛选，10天后大量细胞空泡化，第18天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选4周后，G418浓度降至100μg/ml维持筛选，待镜下可见较大阳性克隆，使用滤纸片法将阳性克隆消化后，并将其种植于48孔板中，得到抗G418阳性细胞。

④将筛选的细胞在CO2培养箱中培养，每隔2～3天传代一次，连续培养超过50代次，即得永生化的细胞系。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备的一种永生化的鸭胚肝细胞系。

永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。

本发明的再一目的在于提供一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，所述方法包括：（1）培养增殖所述永生化的鸭胚肝细胞系；（2）在培养的所述永生化的鸭胚肝细胞系中接种鸭病毒性肝炎病毒，培养增殖所述鸭病毒性肝炎病毒；（3）收获所述培养的鸭病毒性肝炎病毒，灭活。

本发明建立的鸭胚肝细胞系接种鸭病毒性肝炎病毒能产生明显病变，可以用来测定鸭病毒性肝炎卵黄抗体，此方法成本低，使用方便，且准确度高，可以大规模的推广。

优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

本发明的又一目的在于提供所述方法制备的鸭病毒性肝炎疫苗。

本发明的还一目的在于提供一种测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的方法，所述方法包括：

（1）将所述的鸭胚肝细胞系接种于细胞瓶中，待长满单层后，传代于96孔板中，每孔1.5～2.0×10⁵个细胞，继续培养；