[发明专利]CRISPR-Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA

说明书

本发明公开了一种运用CRISPR‑Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA。本发明的特异性靶向FGL2基因的sgRNA在FGL2基因上的靶序列符合5’‑N(20)NGG‑3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G；在FGL2基因上的靶序列位于FGL2基因的外显子编码区；在FGL2基因上的靶序列是唯一的。本发明的sgRNA用于CRISPR‑Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法中，能够快速、精确、高效、特异性地敲除猪FGL2基因，有效地解决构建FGL2基因敲除猪周期长和成本高的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因敲除技术领域，具体涉及CRISPR-Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA。

背景技术

器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。以肾脏移植为例，我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部分患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其他物种，以提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。

目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，以产生适合于人体移植的器官，成为异种移植的终极目标。

Fibrinogen-like protein 2(FGL2)具有高度保守的纤维蛋白原结构域，它既可以表达在细胞膜表面也可以被分泌到细胞外，膜表面的FGL2是一个直接的凝血酶原酶，而分泌到胞外的FGL2具有免疫调节作用。在缺少经典的凝血酶原酶复合体的情况下，FGL2促进促凝血酶向凝血酶的转化。纤维素沉积是AVR的一种典型特征。利用抗体中和或者FGL2敲除的小鼠，FGL2的缺失会抑制纤维素的沉积。凝血酶是一个潜在的免疫激活因子，它可以激活血小板，并且直接作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞，而血管内皮细胞的激活会促进血栓的形成。在小鼠到大鼠的异种心脏移植模型中，作为供体的FGL2缺失的小鼠的确降低了AVR的产生。既然FGL2对于AVR有如此重要的作用，那么构建FGL2缺失的基因修饰猪，将很有可能对异种移植作出重要贡献。

目前，常见的基因敲除技术包括同源重组(Homologus Recombination，HR)技术、类转录激活效应子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-Finger Nuclease，ZFN)技术以及最近发展的规律成簇间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技术。HR技术由于重组效率低下(效率大约只有10^-6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20％，但都需要构建可以识别特定序列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱靶率，其应用有限。