[发明专利]用于差分检测的嵌入染料

说明书

提供了用于检测和定量核酸序列的方法和组合物。

相关申请的交叉参考

本申请要求于2014年1月10日提交的美国临时申请61/926,172号的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

可检测或定量核酸以搜索有用的基因、诊断疾病或鉴定生物体。设计为检测或定量核酸的分子方法可用于检测突变、检测稀有核酸、定量基因表达、测量RNA稳定性等。这类分子方法可用于确定核酸的相对比例。例如，分子方法可用于确定与样品中野生型核酸的丰度相比突变或多态性核酸的丰度。

用于检测或定量核酸的方法和组合物包括数字方法，其中样品被分为多个混合物划分产物并确定各划分产物中是否存在一种或多种感兴趣的核酸。在一些情况中，两种或多种检测试剂或探针被用于检测划分产物中两种或多种感兴趣的核酸。在这类情况中，探针或其他检测试剂的交叉反应性可使得难以明确地检测或定量感兴趣的核酸。例如，当一种感兴趣的核酸比另一种更普遍时，例如当一种核酸代表野生型序列且另一种代表突变时，检测试剂的交叉反应性可造成特别的困难。当一种感兴趣的核酸与另一种非常类似时，交叉反应性也可造成特别的困难。

发明内容

在一些实施方式中，本发明提供一种核酸序列检测方法，包括：提供包含DNA或RNA核酸的样品；将所述样品划分为一组混合物划分产物；使用序列特异性检测试剂检测划分产物中是否存在靶核酸；以及使用非特异性检测试剂检测划分产物中是否存在双链核酸，从而检测划分产物中靶核酸与总核酸的比率。

在一些方面中，在检测前扩增核酸。在一些情况中，该非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸。例如，该非特异性检测试剂是在扩增步骤期间掺入至一个或多个结构上不同的扩增子中的标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸，并检测一个或多个结构上不同的扩增子中掺入的标记物。

在一些方面中，该非特异性检测试剂是嵌入染料。例如，该嵌入染料可选自：EvaGreen、picogreen、溴化乙啶、SYBR Green I、SYBR Gold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。在一些方面中，该序列特异性检测试剂选自结构化探针(structured probe)和线性探针。在一些情况中，该结构化探针选自分子信标和蝎型探针(scorpion probe)。在一些情况中，该线性探针选自杂交探针和水解探针。

在一些方面中，该非特异性检测试剂是检测总双链核酸的引物(或引物的混合物，如随机引物的混合物)。

在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该核酸是RNA，且该方法还包括逆转录该RNA核酸。

在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括扩增两种或多种潜在的扩增子。在一些方面中，在存在双链核酸的混合物划分产物中，潜在的扩增子之一的量为小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少。在一些情况中，该序列特异性检测试剂检测一种特异性扩增子，且该非序列特异性检测试剂检测任何扩增子。

在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该序列特异性检测试剂检测序列变体。在一些情况中，该序列变体是稀有序列变体。在一些情况中，双链核酸存在于多个混合物划分产物中，且该稀有序列变体存在于小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少的混合物划分产物中。